高黏附乳酸菌的筛选及其对RAW264.7细胞的免疫调节作用

发布时间：2020-10-27 12:58

　　 乳酸菌是一类有益于宿主健康的微生物,主要通过在肠道中的定植发挥益生作用。乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附、定植作用有助于恢复或增强肠道稳态,提高机体免疫力。因而乳酸菌的黏附能力是评价其益生性的重要指标。然而,有些具有益生功能的乳酸菌作用效果和稳定性却不尽如人意。所以筛选出一株黏附能力高,又具有免疫调节潜力的乳酸菌,对开发高效的免疫调节益生菌制剂尤为重要。本课题旨在从实验室保藏的12株乳杆菌和2株耐久肠球菌中筛选出高黏附性乳酸菌,并分析影响该菌株黏附性的因素,对黏附机制进行初步探究。最后评价了该株高黏附乳酸菌对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用。选取具有良好黏附性能的嗜酸乳杆菌NCFM作为对照,通过对14株不同种乳酸菌进行表面疏水性、自聚集能力以及体外黏附Caco-2细胞能力的测定,筛选出高黏附性乳酸菌菌株。并分析了表面性质与黏附性之间的关系。结果发现嗜酸乳杆菌KLDS 1.0901对Caco-2细胞的黏附率是受试的15株菌中最高的,为12.73%,且KLDS 1.0901具有仅次于耐久肠球菌KLDS6.0933的疏水率,为13.88%。鼠李糖乳杆菌KLDS1.0205的黏附能力最低,为0.13%。不同乳酸菌的表面疏水性与对Caco-2细胞的黏附能力呈现一定的相关性。采用体外实验探究了高黏附性嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的浓度、生长阶段、化学和酶处理对其黏附Caco-2细胞能力的影响。试验结果表明,KLDS1.0901的生长阶段显著影响其黏附性。菌体浓度为10~8~10~(10) CFU/mL时,对黏附性影响不显著。KLDS1.0901对Caco-2细胞的黏附可能是以表层蛋白为主的多种黏附素共同作用的结果。结合透射电镜和SDS-PAGE技术,初步分离、鉴定了KLDS1.0901的表层蛋白。结果表明KLDS1.0901表面具有丰富的绒毛状表层蛋白,含量约为15.6%,分子量大约为43 kDa。并证实表层蛋白粗提物能显著抑制KLDS1.0901对Caco-2的黏附,且浓度越大,抑制作用越强。采用流式细胞术分析了未处理、去除表层蛋白和热致死的KLDS1.0901在小鼠肠道中的定植与分布。结果表明,KLDS1.0901在灌胃前期主要黏附于十二指肠和空肠,后期KLDS1.0901趋向于黏附结肠。而去除表层蛋白和热灭活的KLDS1.0901虽然在第一天能大量黏附于十二指肠,但是只能短暂停留于肠道各部位,随着时间推移,这两组在肠道各部位的黏附量显著减少。从体内证实了KLDS1.0901也能在小鼠肠道内长时间黏附定植,并且其表面的表层蛋白同样能显著影响其在体内的黏附能力。体外探究了高黏附菌株KLDS1.0901对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用。测定了不同剂量的未处理KLDS1.0901(LLA)、去除表层蛋白KLDS1.0901(RSLA)和热致死的KLDS1.0901(HKLA)对巨噬细胞增殖能力及吞噬作用的影响;以及刺激巨噬细胞后IL-10和TNF-α分泌水平及其对应mRNA的表达量。试验结果表明:当菌体与巨噬细胞以10:1和1:1共同孵育时,LLA和HKLA组均能显著促进巨噬细胞的增殖,但只有LLA能显著促进巨噬细胞的吞噬活性。在所有浓度下,RSLA组均显著抑制了巨噬细胞活性。并证实KLDS1.0901表面的表层蛋白是增强巨噬细胞活性的重要物质,当以500μg/mL的表层蛋白粗品刺激巨噬细胞时,其增殖和吞噬活性最强。KLDS1.0901与巨噬细胞以1000:1共同孵育时,与空白对照组相比,LLA显著抑制了IL-10和TNF-的分泌。其他浓度条件下:LLA,RSLA和HKLR组IL-10的分泌水平均显著高于对照组,但远低于LPS组;LLA、RSLA和HKLA能够诱导细胞分泌与LPS组相同水平的TNF-α。与空白对照组相比,当菌体与巨噬细胞以100:1共培养时,LLA和HKLA均能显著上调IL-10和TNF-mRNA表达水平。这与细胞因子水平的测定结果相佐证。结论为筛选得到一株表层蛋白含量丰富、黏附性高和具有免疫调节潜力的嗜酸乳杆菌KLDS1.0901。该菌株有作为粘膜疫苗载体使用的潜能,亦可开发成高效调节机体免疫的益生菌。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 立题背景
    1.2 文献综述
        1.2.1 乳酸菌在人和动物体内的分布
        1.2.2 益生乳酸菌的黏附作用研究进展
        1.2.3 巨噬细胞的免疫功能
        1.2.4 乳酸菌的黏附与免疫调节的关系
    1.3 研究目的及意义
    1.4 主要研究内容
    1.5 课题来源
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验菌株
        2.1.2 试验细胞
        2.1.3 试验动物
        2.1.4 培养基
        2.1.5 试剂与来源
        2.1.6 仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株的培养与保藏
        2.2.2 Caco-2 细胞培养与保藏
        2.2.3 RAW264.7 细胞培养与保藏
        2.2.4 高黏附性乳酸菌的筛选
        2.2.5 影响乳酸菌黏附性的因素分析
        2.2.6 KLDS1.0901对RAW264.7 免疫活性的影响
        2.2.7 数据分析
3 结果与分析
    3.1 高黏附性乳酸菌的筛选
        3.1.1 乳酸菌的疏水性
        3.1.2 乳酸菌的自凝聚能力
        3.1.3 乳酸菌对Caco-2 细胞的黏附能力
        3.1.4 乳酸菌对Caco-2 黏附观察
        3.1.5 乳酸菌表面疏水性与黏附性相关性分析
    3.2 影响嗜酸乳杆菌KLDS1.0901 黏附性的因素分析
        3.2.1 浓度对黏附性的影响
        3.2.2 生长阶段对黏附性的影响
        3.2.3 化学和酶处理对黏附的影响
        3.2.4 表层蛋白的分离鉴定
        3.2.5 表层蛋白对KLDS1.0901 黏附性的影响
        3.2.6 体内黏附试验
    3.3 KLDS1.0901对RAW264.7 免疫活性的影响
        3.3.1 KLDS1.0901对RAW264.7 细胞增殖能力的影响
        3.3.2 KLDS1.0901对RAW264.7 细胞吞噬活性的影响
        3.3.3 SLP粗品对巨噬细胞增殖的影响
        3.3.4 SLP粗品对巨噬细胞吞噬活性的影响
        3.3.5 不同处理KLDS1.0901 对细胞因子IL-10和TNF-的影响
        3.3.6 IL-10和TNF-mRNA的相对表达量
4 讨论
    4.1 高黏附性乳酸菌的筛选
        4.1.1 乳酸菌的表面性质与黏附性的关系
        4.1.2 不同乳酸菌对Caco-2 细胞模型的黏附能力
    4.2 影响KLDS1.0901 黏附性的主要因素分析
        4.2.1 乳酸菌的浓度与生长期对黏附性的影响
        4.2.2 KLDS1.0901 的表层蛋白对黏附性的影响
    4.3 KLDS1.0901 对巨噬细胞免疫活性的影响
        4.3.1 KLDS1.0901 对巨噬细胞活性的影响
        4.3.2 KLDS1.0901 对巨噬细胞分泌细胞因子水平的影响
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文

【参考文献】

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本文编号：2858553