小麦内质网氧化还原酶的分子改造与毕赤酵母重组高效表达
发布时间：2020-10-27 22:44
小麦内质网氧化还原酶(wEro1)具有显著提高面粉加工品质的能力,有望成为提高面粉筋力的新型生物改良剂。但其用于工业生产应用,仍有一定的局限性。受催化效率、表达量、稳定性等限制,生产成本相对较高。本文以wEro1为研究对象,在对野生型wEro1的基本性质进行探讨的基础上,通过理性设计对其进行分子改造,最终获得了活性得到提升的正向突变体。同时,利用毕赤酵母表达系统表达了野生型wEro1,经优化后实现了wEro1的异源高效表达。主要研究内容:(1)wEro1基本性质的测定。大肠杆菌重组wEro1的比酶活为201.35±14.37 U/mg;最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃;在低温和中性条件下稳定性较好;Cu~(2+)等金属离子对wEro1表现出明显的抑制作用;SDS、Tween-20和Triton X-100对wEro1的活性都表现出一定的抑制作用。(2)wEro1的分子改造。以序列同源性分析和同源建模结构为指导,通过理性设计,选择了处于活性位点或活性调控相关的9个半胱氨酸残基进行定点突变,应用重叠延伸PCR技术实现了9个半胱氨酸残基的定点突变,进一步构建了重组突变型wero1基因的原核表达载体。(3)正向突变体的筛选。在大肠杆菌表达体系中,成功可溶表达了8个突变型重组wEro1,筛选得到了5个活性得到提升的正向突变体,分别是:C105A(wEro1的第105位半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基)、C124A、C149A、C220A和C229A,其中,活性增加最为明显的是C220A和C105A,分别增加了119.64%和101.74%的活性。(4)wEro1在毕赤酵母中的高效表达。成功构建了wEro1的真核表达载体pPICZαA-wero1,并实现了其在毕赤酵母GS115中的表达。通过单因素试验和正交试验优化了表达条件,优化后其表达量可达53.24?2.11 U/mL。等体积发酵液下,毕赤酵母表达系统表达量是大肠杆菌表达系统表达量的14.7倍,实现了wEro1的高效表达。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
图 1-1 Ero1 催化二硫键形成示意图ure 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfide 源的 Ero1 均含有多对二硫键，其中两对构成了高度保守Ero1 催化氧化过程中的电子转移（图 1-2）[18]。内活性位间位置上靠近核心催化区域的辅基 FAD 分子，方便其中被氧化成二硫键。外活性位点包含 C-X-X-X-X-C 基序，无规卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承担将底物半胱氨酸残基的6]。
图 1-1 Ero1 催化二硫键形成示意图e 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfid的 Ero1 均含有多对二硫键，其中两对构成了高度保守o1 催化氧化过程中的电子转移（图 1-2）[18]。内活性位位置上靠近核心催化区域的辅基 FAD 分子，方便其中氧化成二硫键。外活性位点包含 C-X-X-X-X-C 基序规卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承担将底物半胱氨酸残基的。
第一章 绪论高活性状态，产生过量过氧化氢损伤细胞[19]，然而不同来源 Ero1 的活性反是不一样的。酵母源 Ero1 的催化机制母源 Ero1 的主体结构由十个 α 螺旋组成，核心区域上方覆盖了由上百个氨成的柔性无规卷曲（Loop Ⅰ）[5]，其立体结构如图 1-3 所示。它一共有 14 个基，其中 10 个在这段无规卷曲上或在无规卷曲与核心区域的连接上[1]。只有酸残基是维持其活性所必须的，这 4 个半胱氨酸残基可形成两对二硫键：C内活性位点）和 C100-C105（外活性位点）[20]。C352-C355 位于其辅基 FA00-C105 位于非常灵活的无规卷曲 Loop Ⅰ上。在氧化 PDI 的过程中，C100-C收底物的电子并将电子转移给C352-C355，C352-C355再将电子转移给辅基F将电子转移给氧分子，整个过程伴随着氧气的消耗和过氧化氢的产生[4]。
【参考文献】
本文编号：2859174
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
图 1-1 Ero1 催化二硫键形成示意图ure 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfide 源的 Ero1 均含有多对二硫键，其中两对构成了高度保守Ero1 催化氧化过程中的电子转移（图 1-2）[18]。内活性位间位置上靠近核心催化区域的辅基 FAD 分子，方便其中被氧化成二硫键。外活性位点包含 C-X-X-X-X-C 基序，无规卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承担将底物半胱氨酸残基的6]。
图 1-1 Ero1 催化二硫键形成示意图e 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfid的 Ero1 均含有多对二硫键，其中两对构成了高度保守o1 催化氧化过程中的电子转移（图 1-2）[18]。内活性位位置上靠近核心催化区域的辅基 FAD 分子，方便其中氧化成二硫键。外活性位点包含 C-X-X-X-X-C 基序规卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承担将底物半胱氨酸残基的。
第一章 绪论高活性状态，产生过量过氧化氢损伤细胞[19]，然而不同来源 Ero1 的活性反是不一样的。酵母源 Ero1 的催化机制母源 Ero1 的主体结构由十个 α 螺旋组成，核心区域上方覆盖了由上百个氨成的柔性无规卷曲（Loop Ⅰ）[5]，其立体结构如图 1-3 所示。它一共有 14 个基，其中 10 个在这段无规卷曲上或在无规卷曲与核心区域的连接上[1]。只有酸残基是维持其活性所必须的，这 4 个半胱氨酸残基可形成两对二硫键：C内活性位点）和 C100-C105（外活性位点）[20]。C352-C355 位于其辅基 FA00-C105 位于非常灵活的无规卷曲 Loop Ⅰ上。在氧化 PDI 的过程中，C100-C收底物的电子并将电子转移给C352-C355，C352-C355再将电子转移给辅基F将电子转移给氧分子，整个过程伴随着氧气的消耗和过氧化氢的产生[4]。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 王建伟;温成志;刘全伟;;巯基氧化酶在国产面包粉中应用的初探[J];粮食加工;2010年03期
2 蔡尽忠;;影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素[J];海峡药学;2006年06期
3 赵玉蓉,金宏,陈清华,王红权,沈维军,朱立涛;金属离子对饲料酶活性的影响[J];饲料研究;2004年08期
相关博士学位论文 前1条
1 刘光;重组小麦内源酶wPDI和wErol影响面粉加工品质机理的研究[D];华南理工大学;2017年
本文编号：2859174
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2859174.html
教材专著
