拟南芥响应盐胁迫的代谢组学研究
发布时间：2020-11-03 18:16
盐胁迫是全球范围内影响农作物产量的重要非生物胁迫因子之一。代谢组学是分析生物体受外界刺激、病菌侵染和遗传信息改变等因素引起代谢变化的一门学科,由于可直观了解植物体内代谢产物动态变化,故而在植物应对胁迫响应研究中应用广泛,是植物抗逆性研究的重要手段。本研究以哥伦比亚生态型拟南芥为实验材料,利用NaCl溶液对拟南芥植株进行胁迫处理,采用中性解吸电喷雾萃取电离质谱(Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry,ND-EESI-MS)、超高效液相串联四级杆飞行时间质谱联用(Ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)和高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)三种代谢组学技术分析了拟南芥在盐胁迫下的代谢产物。主要研究结果如下。1、用50、100、200和300 mM NaCl溶液胁迫处理拟南芥1、4、7 d,采用新兴的直接质谱技术ND-EESI-MS对拟南芥莲座叶进行原位无损分析,正离子模式下获得了不同胁迫处理拟南芥叶ND-EESI-MS代谢产物指纹图谱,通过串联质谱结合有关数据库,定性出丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、杨梅素、原儿茶酸、表儿茶素、桑黄素、异戊烯基香豆素和二苯并呋喃12种代谢物。应对盐胁迫时,丝氨酸、精氨酸、谷氨酸和涉及莽草酸-苯丙素代谢途径的肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、表儿茶素含量在50、100、200 mM NaCl盐胁迫下都升高,且在200 mM时变化最大,但在最高浓度300 mM NaCl盐胁迫下降低。主成分分析(Principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法判别分析(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)结果都显示较高浓度(200 mM和300 mM)盐胁迫处理组都能很好地与实验对照组和较低浓度(50mM和100 mM)盐胁迫处理组区分。ND-EESI-MS技术无需样品预处理,可实现对样品原位活体检测,并且对样品不会造成明显伤害,检后植物可继续生长,可实现对同一株植物的定位持续观察,每个样品检测时间仅仅为30 s,可以实现高通量快速检测。ND-EESI-MS分析技术在研究植物活体代谢组学方面具有一定的前景。2、采用UPLC-QTOF-MS非靶向检测手段分析了200 mM NaCl溶液胁迫下拟南芥叶醇提物,共鉴定出L-苯丙氨酸、脱落酸、苹果酸、阿魏酸、肉桂酸、芦丁、半乳糖、尿苷、糖芥子苷等34种化合物。应对盐胁迫时,拟南芥体内脱落酸积累,L-苯丙氨酸含量显著降低(p0.05),苹果酸、原儿茶酸、没食子酸、山奈酚和芦丁显著降低(p0.05),涉及到莽草酸-苯丙素代谢途径中的肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸含量也显著降低,糖代谢中的D-纤维二糖含量显著升高(p0.05),苷类物质变化不尽相同,尿苷、磷酸鸟苷和萝卜硫苷含量显著降低(p0.05),而芸薹葡萄糖硫苷含量显著升高(p0.05)。这些物质主要涉及到了氨基酸、莽草酸-苯丙素和糖类等代谢途径,拟南芥通过这些途径的一系列变化以响应盐胁迫。3、采用HPLC结合标准品靶向检测了200 mM NaCl溶液胁迫下拟南芥叶醇提物中的酚类物质,共检测到10种酚类物质。与实验对照组相比,盐胁迫处理组中原儿茶酸、咖啡酸、芦丁、肉桂酸和桑黄素含量显著降低(p0.05),其中肉桂酸含量降低了3倍以上;表儿茶素和(+)-儿茶酸含量显著升高(p0.05),其中(+)-儿茶酸含量升高了近3倍。显著性差异较大的7种酚类物质都与植物体内莽草酸-苯丙素代谢过程相关,在拟南芥响应盐胁迫时起到了关键调控作用。本文首先利用新兴的直接质谱技术ND-EESI-MS实现对盐胁迫下拟南芥非靶向代谢组学的快速无损检测,基于ND-EESI-MS结果,进一步确定200 mM NaCl为处理浓度,采用UPLC-QTOF-MS和HPLC研究了盐胁迫下拟南芥的代谢产物变化。研究结果在代谢组学层面上揭示盐胁迫对拟南芥中代谢物的影响,为进一步揭示植物响应盐胁迫的代谢调控机理提供了理论基础。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q945.78
【部分图文】：
第 1 章 引言atmospheric pressure chemical ionization，DAPCI）[37]、实时直接分析（Directanalysis in real time，DART）[38]，超声喷雾解吸电离（Desorption sonic sprayionization，DeSSI）[39]、电喷雾萃取电离（Extractive electrospray ionization，EESI）[40]、介质阻挡放电电离（Dielectric barrier discharge ion，DBDI）[41]、低温等离子体探针（Low-temperature plasma，LTP）[42]、常压激光解吸电离（An atmosphericpressure laser desorption ionization，APLDI）[43]、内部萃取电喷雾电离质谱（Internalextractive electrospray ionization mass spectrometry，iEESI-MS）[44]和中性解吸-电喷雾萃取电离质谱（ND-EESI-MS）[45]等，已广泛应用于生命科学、食品安全、环境分析、医学等众多领域，在人类社会的生产和生活中扮演着越来越重要的角色。这些常压电离方式的基本原理可以归纳为，首先利用能量源，如光子电子电场加热等方式，获得初级离子，然后利用初级离子与原始样品作用，进而发生电荷转移或能量传递将待测组分电离，最后进入质谱进行检测。+++++++++++++++++ +++++++++++++Charged droplets(a) (b)HVDischarge needle
2.1.4 ND-EESI-MS实验条件图 2.1 为自行搭建的 ND-EESI-MS 分析原位分析样品示意图，选取拟南芥植株上大小均一的莲座叶叶片，将加工的采样装置置于叶片表面，由阀门控制的氮气直接用作解吸气，原位分析拟南芥叶子样品表面组分。实验各个参数经过优化之后进行，分析物在 EESI 环境中进行离子化，出样品口和电喷雾束形成一个 60o 的角度（β），两者之间的距离（a）为 2 mm。电喷雾和 LTQ 仪器离子传输管之间角度（α）和样品出口和 LTQ 仪器离子传输管之间角度（γ）都 150o。整个 EESI 装置和 LTQ 仪器离子传输管相平行，和 LTQ 仪器离子入口的距离（b）为 5 mm。EESI 离子源以甲醇：水=1：1（v/v）为萃取剂，萃取溶剂以 2 mL/min的流速通过石英毛细管。在微量进样针的钢针部位施加 3.5 kV 正高压，在电场的作用下，样品前端产生大量承载待测物的微小带电液滴，这些微小带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子，引入到质谱仪中进行检测，质谱仪的扫描范围为 m/z 50-800。
图 2.2 盐胁迫处理组和实验对照组拟南芥生长情况（盐胁迫处理组对拟南芥分别施加 50、100、200 和 300 mM NaCl 溶液，盐胁迫处理 1、4、7 d，实验对照组为正常浇水处理）Figure 2.2 The growth of A.thaliana in salt stress treatment group and experimental control group(salt stress treatment group applied 50 mM, 100 mM, 200 mM and 300 mM NaCl solution toA.thaliana, salt stress treatment for 1、4、7 d, the experimental control group is normal wateringtreatment)2.2.2盐胁迫下拟南芥叶中的代谢产物实验条件经优化，如图 2.1 所示，在正离子模式下，采用新兴的直接质谱技术 ND-EESI-MS 直接原位活体检测拟南芥莲座叶，获取不同盐胁迫条件下拟南芥样品的所有质谱指纹图谱信息，每个样品仅用 30 s 就可从植物叶中获得如图2.3 中所示的指纹图谱信息。以获得的盐胁迫 7 d 下拟南芥莲座叶的一级指纹图谱为例，利用该方法分别获得了盐胁迫 7 d 下在 50 mM、100 mM、200 mM、300mM 的拟南芥叶指纹图谱信息，从一级指纹图谱上可以直观地看到质荷比的变化，这些图谱有许多共性，如都有 m/z 163、m/z 217、m/z 261、m/z 300、m/z 305、
【参考文献】
本文编号：2868926
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q945.78
【部分图文】：
第 1 章 引言atmospheric pressure chemical ionization，DAPCI）[37]、实时直接分析（Directanalysis in real time，DART）[38]，超声喷雾解吸电离（Desorption sonic sprayionization，DeSSI）[39]、电喷雾萃取电离（Extractive electrospray ionization，EESI）[40]、介质阻挡放电电离（Dielectric barrier discharge ion，DBDI）[41]、低温等离子体探针（Low-temperature plasma，LTP）[42]、常压激光解吸电离（An atmosphericpressure laser desorption ionization，APLDI）[43]、内部萃取电喷雾电离质谱（Internalextractive electrospray ionization mass spectrometry，iEESI-MS）[44]和中性解吸-电喷雾萃取电离质谱（ND-EESI-MS）[45]等，已广泛应用于生命科学、食品安全、环境分析、医学等众多领域，在人类社会的生产和生活中扮演着越来越重要的角色。这些常压电离方式的基本原理可以归纳为，首先利用能量源，如光子电子电场加热等方式，获得初级离子，然后利用初级离子与原始样品作用，进而发生电荷转移或能量传递将待测组分电离，最后进入质谱进行检测。+++++++++++++++++ +++++++++++++Charged droplets(a) (b)HVDischarge needle
2.1.4 ND-EESI-MS实验条件图 2.1 为自行搭建的 ND-EESI-MS 分析原位分析样品示意图，选取拟南芥植株上大小均一的莲座叶叶片，将加工的采样装置置于叶片表面，由阀门控制的氮气直接用作解吸气，原位分析拟南芥叶子样品表面组分。实验各个参数经过优化之后进行，分析物在 EESI 环境中进行离子化，出样品口和电喷雾束形成一个 60o 的角度（β），两者之间的距离（a）为 2 mm。电喷雾和 LTQ 仪器离子传输管之间角度（α）和样品出口和 LTQ 仪器离子传输管之间角度（γ）都 150o。整个 EESI 装置和 LTQ 仪器离子传输管相平行，和 LTQ 仪器离子入口的距离（b）为 5 mm。EESI 离子源以甲醇：水=1：1（v/v）为萃取剂，萃取溶剂以 2 mL/min的流速通过石英毛细管。在微量进样针的钢针部位施加 3.5 kV 正高压，在电场的作用下，样品前端产生大量承载待测物的微小带电液滴，这些微小带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子，引入到质谱仪中进行检测，质谱仪的扫描范围为 m/z 50-800。
图 2.2 盐胁迫处理组和实验对照组拟南芥生长情况（盐胁迫处理组对拟南芥分别施加 50、100、200 和 300 mM NaCl 溶液，盐胁迫处理 1、4、7 d，实验对照组为正常浇水处理）Figure 2.2 The growth of A.thaliana in salt stress treatment group and experimental control group(salt stress treatment group applied 50 mM, 100 mM, 200 mM and 300 mM NaCl solution toA.thaliana, salt stress treatment for 1、4、7 d, the experimental control group is normal wateringtreatment)2.2.2盐胁迫下拟南芥叶中的代谢产物实验条件经优化，如图 2.1 所示，在正离子模式下，采用新兴的直接质谱技术 ND-EESI-MS 直接原位活体检测拟南芥莲座叶，获取不同盐胁迫条件下拟南芥样品的所有质谱指纹图谱信息，每个样品仅用 30 s 就可从植物叶中获得如图2.3 中所示的指纹图谱信息。以获得的盐胁迫 7 d 下拟南芥莲座叶的一级指纹图谱为例，利用该方法分别获得了盐胁迫 7 d 下在 50 mM、100 mM、200 mM、300mM 的拟南芥叶指纹图谱信息，从一级指纹图谱上可以直观地看到质荷比的变化，这些图谱有许多共性，如都有 m/z 163、m/z 217、m/z 261、m/z 300、m/z 305、
【参考文献】
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本文编号：2868926
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