蛋白激酶YihE的细胞通路及调控机制
发布时间：2020-11-04 03:10
现今,越来越多超级抗药细菌的出现对人类的健康产生了严重的威胁。面对众多的多重抗药致病菌,单靠开发新药的传统方法是远远不够的,我们亟需新的策略。因此,近年来人们开始关注细菌耐药性的分子机理,希望以此找到新的突破点。我们前期的研究表明,大肠杆菌(Escherichia coli)YihE激酶是细胞程序性死亡途径的关键调控因子,在抗生素处理细菌时能起到保护细菌的作用。然而,YihE激酶的细胞通路及其在细胞内的调控机制尚不清楚。为了了解YihE的具体调控机制,在本论文工作中我们首先利用转录组测序筛选出表达受yihE突变影响的基因。通过对相关基因的功能进行分析发现,受yihE突变影响的通路主要有硝酸盐还原途径、ED途径(戊糖磷酸途径)以及葡萄糖代谢及转运相关途径。通过药敏实验发现这些途径中的narK、gntK、fruK、gntT、edd、narG和ptsG等基因在萘啶酸处理时对细菌具有保护作用。对于硝酸盐还原途径的关键酶NarG的研究表明,硝酸盐还原酶NarG通过为细菌药物外排泵提供质子驱动力而保护细胞。同时,△yihE突变株中NO水平升高说明YihE对于细胞的保护作用涉及到硝化应激。药物处理条件下△yihE突变株相对于野生型菌株胞内游离铁水平与ROS水平均上升,表明YihE可能通过控制细胞内游离铁水平进而降低细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,从而起到对细菌的保护作用。因此,我们提出YihE的细胞通路及调控机制:1)YihE通过磷酸化其靶蛋白,调控细胞内硝酸盐代谢,使细胞内活性氮(Reactive Nitrogen species,RNS)水平不至于过高影响到细胞的存活;2)YihE可能磷酸化DnaK,DnaK负调控ED途径以减少ROS对细菌的毒害作用,最终避免细胞死亡。本研究揭示了 YihE激酶的部分通路及其调控机制,为我们今后针对细菌自我保护机制开发药物,提高现有药物的杀菌效率提供了理论依据。
【学位单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q932
【部分图文】：
ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｋｉｎａｓｅ?Ａ?），是一种?Ｓｅｒ／Ｔｈｒ?蛋白激酶（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?）。??ＹｉｈＥ的整体结构是典型的双叶蛋白激酶，在Ｎ末端区域具有较小的、主要??是Ｐ－折叠的结构域。在Ｃ－末端区域具有较大的、主要是ａ－螺旋结构域（图１－１）。??这两个结构域通过短的（？１０个残基）铰链连接，产生开放的裂缝（裂缝１，图??１－１），其对应于所有激酶中的磷酸转移区。Ｎ末端结构域以８个残基的环开始，??接着是螺旋Ａ，其位于由五链扭曲的反平行Ｐ－折叠组成的保守的激酶结构之上??（图１－１）。螺旋Ｂ包围裂口?１形成口袋，推测是ＡＴＰ结合位点⑵。这种Ｎ－末端??结构域是真核激酶的典型结构，构成所有蛋白激酶中存在的“必需”激酶折叠的??一部分［３］。其余的必需激酶结构在Ｃ末端结构域内，它主要由ａ－螺旋组成，可以??细分为围绕第二个较大裂隙的两个裂片（裂隙２，图１－１）。左叶由四个ａ－螺旋和??一个长发夹形环组成
簇的脱水酶，将蛋白结合铁释放到细胞质中形成游离Ｆｅ２＋，然后Ｈ２０２与Ｆｅ２＋通??过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生轻自由基ＯＨ？与Ｆｅ３＋，最后轻自由基损伤蛋白、ＤＮＡ或脂??质，最终引起细胞死亡（图１－２）【１７，１８】。??ＮｄｈＨ??＾?ｆａｄｈ２??〇２?＋?Ｈ２０２??Ｆｅ??Ｆｅ?备??ＦＡＤＨ＊＾＾Ｆｅ２＾＾?Ｈ２Ｏｚ??ＦＡＤＨ２－＾?＾?Ｆｅ３＇＾?＾?ＨＯ－?Ｈ２０??感；－，?．％ｄ！?＂ｓｍ－??图１－２?Ｆｅｎｔｏｎ反应与轻自由基的产生??（来自?Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，?Ａｎｎｕａｌ?Ｒｅｖｉｅｗ?ｏｆ?Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，?２００３；?５７（１）：３９５）??１．３．１抗生素诱导ＲＯＳ生成??长期以来人们一直认为抗生素的作用机理是通过作用于特异性靶点发挥其??杀菌作用。例如Ｐ－内酰胺类抗生素通过与细菌青霉素结合蛋白（ＰＢＰｓ）结合，抑??制细菌细胞壁的增长从而抑制细菌的生长。氨基糖苷类抗生素具有阳离子亲和性，??能结合革兰氏阴性杆菌外膜和核酸中的带负电荷的残基，它们通过与原核１６Ｓ??ｒＲＮＡ的结合抑制细菌蛋白质合成和破坏细菌细胞膜的完整性从而达到杀菌的效??果［１９］。氟嗤诺酮类药物是通过与ＤＮＡ促旋酶（拓扑异构酶ＩＩ，ｇｙｒ．４和ｇｙｒ５基??因的产物）和／或拓扑异构酶ＩＶ?和；基因的产物）的直接结合，使得??４??
ｎａｌ）相对于野生型不加药（Ｗ）表达变化较明显的基因有７３个（表３－??３）。Ａｙ／紐突变株加药（Ｙ＿ｎａｌ）相对于Ａｙ仇Ｅ突变株不加药（Ｙ）表达变化较明??显的基因有６９个（表３－４）。从图中（图３－１）可以直观看到，突变株中部??分基因变化明显，说明这些基因对应的代谢途径受到ＹｉｈＥ的调控。同时，同一??菌株药物处理相对于正常条件下发生变化的基因明显变多，说明抗生素对细胞的??影响是很广泛的。??８０?－Ｉ???Ｏｉｌ??Ｙ?ｖｓ?Ｗ?Ｖ＿ｎａ！?ｖｓ?Ｗ＿ｎａｌ?Ｗ＿ｒ？ａ！?ｖｓ?Ｗ?Ｙ＿ｎａｌ?ｖｓ?Ｙ??图３－１显著差异表达基因数目统计图??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ｇｅｎｅｓ??１８??
【相似文献】
本文编号：2869525
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【学位年份】：2019
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【部分图文】：
ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｋｉｎａｓｅ?Ａ?），是一种?Ｓｅｒ／Ｔｈｒ?蛋白激酶（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?）。??ＹｉｈＥ的整体结构是典型的双叶蛋白激酶，在Ｎ末端区域具有较小的、主要??是Ｐ－折叠的结构域。在Ｃ－末端区域具有较大的、主要是ａ－螺旋结构域（图１－１）。??这两个结构域通过短的（？１０个残基）铰链连接，产生开放的裂缝（裂缝１，图??１－１），其对应于所有激酶中的磷酸转移区。Ｎ末端结构域以８个残基的环开始，??接着是螺旋Ａ，其位于由五链扭曲的反平行Ｐ－折叠组成的保守的激酶结构之上??（图１－１）。螺旋Ｂ包围裂口?１形成口袋，推测是ＡＴＰ结合位点⑵。这种Ｎ－末端??结构域是真核激酶的典型结构，构成所有蛋白激酶中存在的“必需”激酶折叠的??一部分［３］。其余的必需激酶结构在Ｃ末端结构域内，它主要由ａ－螺旋组成，可以??细分为围绕第二个较大裂隙的两个裂片（裂隙２，图１－１）。左叶由四个ａ－螺旋和??一个长发夹形环组成
簇的脱水酶，将蛋白结合铁释放到细胞质中形成游离Ｆｅ２＋，然后Ｈ２０２与Ｆｅ２＋通??过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生轻自由基ＯＨ？与Ｆｅ３＋，最后轻自由基损伤蛋白、ＤＮＡ或脂??质，最终引起细胞死亡（图１－２）【１７，１８】。??ＮｄｈＨ??＾?ｆａｄｈ２??〇２?＋?Ｈ２０２??Ｆｅ??Ｆｅ?备??ＦＡＤＨ＊＾＾Ｆｅ２＾＾?Ｈ２Ｏｚ??ＦＡＤＨ２－＾?＾?Ｆｅ３＇＾?＾?ＨＯ－?Ｈ２０??感；－，?．％ｄ！?＂ｓｍ－??图１－２?Ｆｅｎｔｏｎ反应与轻自由基的产生??（来自?Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，?Ａｎｎｕａｌ?Ｒｅｖｉｅｗ?ｏｆ?Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，?２００３；?５７（１）：３９５）??１．３．１抗生素诱导ＲＯＳ生成??长期以来人们一直认为抗生素的作用机理是通过作用于特异性靶点发挥其??杀菌作用。例如Ｐ－内酰胺类抗生素通过与细菌青霉素结合蛋白（ＰＢＰｓ）结合，抑??制细菌细胞壁的增长从而抑制细菌的生长。氨基糖苷类抗生素具有阳离子亲和性，??能结合革兰氏阴性杆菌外膜和核酸中的带负电荷的残基，它们通过与原核１６Ｓ??ｒＲＮＡ的结合抑制细菌蛋白质合成和破坏细菌细胞膜的完整性从而达到杀菌的效??果［１９］。氟嗤诺酮类药物是通过与ＤＮＡ促旋酶（拓扑异构酶ＩＩ，ｇｙｒ．４和ｇｙｒ５基??因的产物）和／或拓扑异构酶ＩＶ?和；基因的产物）的直接结合，使得??４??
ｎａｌ）相对于野生型不加药（Ｗ）表达变化较明显的基因有７３个（表３－??３）。Ａｙ／紐突变株加药（Ｙ＿ｎａｌ）相对于Ａｙ仇Ｅ突变株不加药（Ｙ）表达变化较明??显的基因有６９个（表３－４）。从图中（图３－１）可以直观看到，突变株中部??分基因变化明显，说明这些基因对应的代谢途径受到ＹｉｈＥ的调控。同时，同一??菌株药物处理相对于正常条件下发生变化的基因明显变多，说明抗生素对细胞的??影响是很广泛的。??８０?－Ｉ???Ｏｉｌ??Ｙ?ｖｓ?Ｗ?Ｖ＿ｎａ！?ｖｓ?Ｗ＿ｎａｌ?Ｗ＿ｒ？ａ！?ｖｓ?Ｗ?Ｙ＿ｎａｌ?ｖｓ?Ｙ??图３－１显著差异表达基因数目统计图??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ｇｅｎｅｓ??１８??
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