斑马鱼foxp3a和foxp3b的cDNA克隆及其在细菌免疫应答中的表达研究

发布时间：2020-11-06 19:45

　　 调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg细胞)是一类CD4~+T细胞亚群,能够控制体内自身免疫系统对机体造成的损伤。在Treg细胞分化和发育过程中以及维持功能稳定的过程中FOXP3(forkhead-box亚家族成员)发挥着重要功能。硬骨鱼类是同时具有获得性免疫和固有免疫的低等脊椎动物,具有和哺乳动物相类似的T、B淋巴细胞,对它们的研究对于理解免疫分子演化过程具有重要价值。目前大部分研究认为硬骨鱼类能够产生和哺乳类功能相似的Treg细胞,且已经相继从黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鲑(Salmo salar)克隆得到了foxp3的同源分子的全长cDNA,并从斑马鱼(Danio rerio)中克隆了foxp3的同源分子的ORF序列(5’-UTR和3’-UTR为预测序列)。这些研究主要局限于mRNA水平和蛋白水平时空分布表达的研究,对FOXP3参与硬骨鱼类获得性免疫过程及其免疫应答变化情况研究较少。斑马鱼额外的染色体加倍事件导致存在两个拷贝的foxp3同源基因,即foxp3a和foxp3b,使得鱼类的Treg细胞及FOXP3研究变得更加复杂。为了丰富硬骨鱼类FOXP3研究,本研究首先构建了斑马鱼(Danio rerio)cDNA文库,采用RACE技术克隆得到斑马鱼foxp3a和foxp3b基因cDNA(含5’-UTR和3’-UTR),并对其进行了生物信息学分析,在此基础上选择了斑马鱼foxp3a和foxp3b特异性片段分别构建了携带有HIS融合标签重组原核表达质粒,表达和纯化了重组融合蛋白,并制备了抗FOXP3A和FOXP3B的兔源多克隆抗血清,采用间接ELISA以及Western blot方法对多克隆抗血清进行验证。通过半定量PCR和整胚原位杂交技术(WISH)对斑马鱼foxp3a和foxp3b时空表达模式进行研究;另一方面,通过实时荧光定量PCR的方法,对腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后斑马鱼肾脏中免疫因子的应答模式进行研究。主要实验结果如下:1)斑马鱼foxp3a和foxp3b的克隆结果表明,本研究成功克隆得到斑马鱼foxp3a和foxp3b基因cDNA。foxp3a基因的全长cDNA是1819 bp,其中开放阅读框长度为1260 bp,并编码一个由419个氨基酸组成的蛋白质;foxp3b基因的cDNA是1316 bp,其中开放阅读框长为1185 bp,编码394个氨基酸。蛋白预测结果显示斑马鱼FOXP3A和FOXP3B含有FOXP家族的特征性结构,即锌指结构和FKH结构域。多重序列比对结果显示,斑马鱼FOXP3A和FOXP3B氨基酸在锌指结构域、亮氨酸拉链结构域和FKH结构域高度保守。系统进化分析表明,斑马鱼FOXP3A和FOXP3B首先与鱼类聚为一类,其次与哺乳类聚为一支,提示斑马鱼FOXP3A和FOXP3B为哺乳动物FOXP3的直系同源分子。2)斑马鱼foxp3a和foxp3b时间表达模式的实验结果表明,斑马鱼foxp3a和foxp3b的表达水平随着受精卵的发育呈现出一定的规律性变化,foxp3a和foxp3b都是从12hpf开始表达,随着受精卵的发育,foxp3a的表达水平逐渐升高;24 hpf(hours post fertilization)时foxp3b表达量最高,之后随着斑马鱼胚胎的发育,foxp3b的表达水平又出现逐渐降低的趋势;组织表达模式的结果显示斑马鱼foxp3a和foxp3b基因分布广泛,在淋巴组织和非淋巴组织中均有表达;其次采用整胚原位杂交技术检测斑马鱼foxp3a和foxp3b在胚胎发育中的表达模式。分别选择foxp3a基因3’末端1415 bp和foxp3b基因3’末端615 bp的特异区段,反向克隆到pGEM-T-easy载体,成功构建了pGEM-T-easy-foxp3a和pGEM-T-easy-foxp3b原位杂交探针表达载体。体外合成地高辛标记的反义RNA探针。原位杂交结果显示,在胚胎发育至12 h时,foxp3a和foxp3b分布广泛,整个胚胎均有表达,随着胚胎发育逐渐集中到中胚层和头部。3)嗜水气单胞菌感染斑马鱼实验结果显示,在细菌感染过程中,斑马鱼肾脏中il-1β的mRNA表达量相对于PBS组均有显著升高(24 hpi,P=0.026;7 dpi,P=0.002);感染组7 d比24 h的表达量相比显著降低(P=0.026)。foxp3a在细菌感染后24 h比对照组表达量显著升高(P=0.017),感染组7 d比24 h的表达量相比显著降低(P=0.026);foxp3b基因mRNA在细菌感染后24 h(P=0.675)和7 d(P=0.238)表达量相对于PBS组来说无显著性差异。4)本实验通过原核表达FOXP3A和FOXP3B部分片段的重组蛋白,经纯化后制备了多克隆抗血清。实验结果显示,在16℃,IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导10小时的条件下,SDS-PAGE结果表明,51.7 kDa的S-FOXP3A-HIS融合蛋白以包涵体形式大量表达,49.5 kDa的S-FOXP3B-HIS蛋白在上清中大量表达。ELISA检测显示,多克隆抗血清的效价均在1.6×10~5以上。进一步通过Western blot方法鉴定抗血清能否识别融合蛋白,研究表明,获得的多克隆抗血清能识别FOXP3A和FOXP3B融合蛋白。本研究一方面成功克隆了斑马鱼foxp3a和foxp3b的cDNA(含5’-UTR和3’-UTR),并通过多种方法检测了多个组织中的mRNA水平表达模式,证实斑马鱼foxp3a和foxp3b不仅表达于淋巴样组织中而且还表达于非淋巴组织中。硬骨鱼类与哺乳类foxp3保守的mRNA水平表达模式提示其可能具有保守的生物学功能;另一方面,研究了嗜水气单胞菌感染的过程中,斑马鱼foxp3a和foxp3b基因在免疫应答过程中的表达情况,初步表明foxp3a可能是斑马鱼中有功能的同源分子,同时也提示在低等脊椎动物中foxp3可能在免疫中同样发挥了重要作用。另外,本研究制备的多克隆抗血清为今后更深入的研究斑马鱼FOXP3A和FOXP3B打下了基础。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;S917.4
【部分图文】：

斑马鱼 foxp3a 和 foxp3b 的 cDNA 克隆及其在细菌免疫应答中的表达研究.4 FOXP 系统进化树系统进化分析表明，斑马鱼FOXP3A与草鱼FOXP3聚为一分类亚支，而FOXP3黑青斑河豚、大西洋鲑和河豚 FOXP3 聚为一支，然后进一步与其他物种的 FOXP为一支，与 FOXP 家族的其他几个成员（FOXPl/2/4）聚为不同的分类支，提示斑鱼 FOXP3A 和 FOXP3B 为哺乳动物 FOXP3 的同源分子，而斑马鱼 FOXP3 可能源部分鱼类特有的基因组复制（图 2.4）。

图 2.5 foxp3 在人和斑马鱼染色体上的基因位置图。人和斑马鱼 foxp3 基因相对位置是在 EnsemGenome Browser 网站（http://www.ensembl.org）上分析得到的。条形框间长度不代表基因间距离Fig2.5 Gene locus maps for foxp3 on human and zebrafish chromosome．Gene maps were constructed using the Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org). The blengths were not proportional to the distances between genes.3 讨论FOXP3 是叉头样转录因子家族中的成员，与调节性 T 淋巴细胞的生成和功能[83]。2001 年 Brunkow 等首次报道了 foxp3，至此后对于 foxp3 的研究受到越

又出现逐渐降低的趋势。图 3.1 斑马鱼不同时间点胚胎中 foxp3a（A）和 foxp3b（B）表达初步DNA 模板；2：没加反转录酶的阴性对照；3：模板为 ddH2O 阴性对照组模板；5：没加反转录酶的阴性对照；6：模板为 ddH2O 阴性对照组 The expression of foxp3a (A)and foxp3b(B) mRNAs in different time after Danio rerio cDNA; 2: Negative control without reverse transcriptase; 3: Negative contro cDNA; 5: Negative control without reverse transcriptase; 6: Negative contro6h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 7d -aCy3M 4 5 6B(bp)50040030020015010050(bp)M 1 2 350040030020015010050A
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本文编号：2873583