重组酶的设计合成、分离纯化及固定化

发布时间：2020-11-13 23:30

　　 作为一种天然催化剂,酶在催化过程中具有高底物特异性、高产物特异性和高催化效率等特点。然而,在酶较为复杂的分离纯化过程中,易失活以及无法回收再利用等缺点也严重限制了其在工业应用的发展。以克服上述酶的缺陷并发挥酶的优异性能为目的,本研究提出了一种高效的分离纯化及固定化的集成化方法来实现这一目的。构建并表达了两种含有融合蛋白标签的β-葡萄糖苷酶(GLEGB,GLEH)。一方面利用ELP标签的温度响应行为,实现目标酶分子的一步快速分离纯化;另一方面利用GB、His标签来强化目标酶在载体材料上的固定化。具体内容如下:(1)设计并通过全基因合成了由ELP纯化标签和石墨烯结合多肽标签的双标签重组β-葡萄糖苷酶质粒pET-GLEGB,由ELP标签和6His标签组成的的二元标签重组β-葡萄糖苷酶质粒pET-GLEH。通过双酶切及PCR验证后证明了重组质粒被成功构建,通过基因测序得到了正确的DNA序列。(2)将β-葡萄糖苷酶转入到受体菌BL21中并在25°C下进行诱导表达。将得到的含有目的酶的粗酶裂解液利用ELP对盐度及温度的敏感性,在25°C,不同浓度的(NH_4)_2SO_4的条件下进行ITC纯化重组酶,并根据酶活回收率及纯化倍数确定最优的(NH_4)_2SO_4浓度为0.5 M。使用一次ITC纯化得到的目的酶的回收率为97.2%,该方法明显优于商业化Ni-NTA亲和层析纯化法的80.6%。(3)利用GB标签的强疏水性,使之与疏水性的碳材料产生较强的吸附力,从而实现通过简单的物理吸附法将GLEGB稳定地固定化于载体材料界面。GLEGB在载体材料GO和C_3N_4表面的固载量分别能达到698.2 mg g~(-1)和527.3 mg g~(-1)。同时,ELP标签还提高了β-葡萄糖苷酶的热稳定性,当在60°C下水浴30 min后,游离GLE和GLEGB剩余的相对酶活分别为45.6%和56.3%,而游离Glu只有4.0%。含有ELP和GB标签的游离酶及固定化酶的贮藏稳定性和重复使用性都有了明显的提升。(4)为了进一步提高固定化酶的操作稳定性和循环利用性能,利用生物矿化固定化酶技术将重组酶GLEH固定化于由纳米级的层状花瓣自组装形成的微米级有机-无机杂化纳米花中。利用6His标签和Cu~(2+)配位作用,将纯化后的GLEH直接进行生物矿化,合成了复合磷酸铜纳米花GLEH-NF。对比Cu~(2+)浓度、酶浓度、制备温度和时间的变化对复合纳米花GLEH-NF形貌及催化性能的影响,并提出了复合纳米花的形成机理。利用超声波辅助法在15 min内即可实现高固载率(81.2%)和酶活回收率(90.3%)。GLEH-NF和游离酶相比,具有129%的相对酶活。通过该方法制备的固定化酶具有高稳定性,重复使用16次后,仍可保留近70%的初始酶活。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q814
【部分图文】：

图 1.1 酶工程的一般过程Fig. 1.1 Flow chart of enzyme engineering一般来说，酶工程的第一步就是根据需要从自然界中筛选找到目的酶。自然界巨大的生物资源宝库，蕴含着极其丰富的微生物。在每克土壤中含有超过一亿，而每种微生物所含的酶也是各不相同。据统计，自然界超过七千种酶，而这辨识和归类的就有超过两千余种[20]。如果通过筛选得到的微生物所产生的酶在性等方面无法满足工业生产的需求，则需要使用定点突变，化学修饰等方法对行分子级别的改造。将改造好的酶分子基因导入到微生物中，通过人工培养发量的目的酶。同时，为了满足对一些大分子量的底物进行有效催化，不仅需要集后破碎获得粗提液，而且还要分离纯化后得到纯酶才能将其应用到工业，农卫生，能源开发和环保等领域。 酶的分离纯化

重组酶的设计合成、分离纯化及固定化白(Elastin-like polypeptide，ELP)是一种重要的人工合成的多单元 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly 串联组成，其中 Xaa 称为“客座氨基酸（脯氨酸除外）[36]。根据其序列、盐浓度的不同，ELP 有不P 都有其特定的相转变温度 Tt(Inverse temperature transition中呈可溶的状态，当环境温度高于其 Tt时，ELP 会变成不可溶变过程如图 1.2 所示，sELP 是 ELP 处于介质温度低于 Tt时溶液温度温度超过 Tt时溶解度变得越来越低。不溶性 ELP淀，从而使其与其他蛋白质分离。然后，含 iELP 的沉淀物溶解在缓冲液中[40]。

图 1.3 传统酶的固定化方法：(a)吸附法；(b) 共价结合法；(c) 包埋法；(d)交联法Fig. 1.3 Enzyme immobilization methods: (a) cross-linking (b) entrapment (c) physical adsorption (d)chemical bonding method1.4.1.1 吸附法吸附法作为一种最简单并且最有效的固定化方式，它主要是依靠范德华力、离子相互作用和氢键等载体和酶之间产生的分子间作用力来实现酶的固定化。由于分子间的作用力通常比较弱，因此极易发生酶的脱吸附。分子间的相互作用力一般不会改变酶的空间结构，也不会干扰酶的活性位点，因此该方法对酶的活性影响也最小[51, 52]。用吸附法制备固定化酶具有操作简单、适用于绝大多数酶、有较高的酶活回收率、载体成本较低且不需要化学修饰等优势。但同时也有一定的缺点，如固定化酶的作用力较弱，不稳定，酶易从载体材料上脱落污染产物等缺点[53]。如大孔树脂[54]、介孔硅[55]和分子筛[56]等材料都是吸附法固定酶的常用材料，也是初代工业化固定化技术应用开发中的热门载体。绝大多数的载体材料都可以通过吸附法固定化酶，然而并不是全部的酶都能通过吸附法固定到这些材料上。要使得酶能够被成功通过吸附法固定化，首先也是必须要满足的条件就是该酶能够和载体材料产生足够的吸
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本文编号：2882787