果蝇E93转录因子对翅发育的调控研究

发布时间：2020-11-16 14:41

　　 昆虫E93转录因子是蜕皮激素下游的初级应答因子之一,在昆虫由蛹向成虫变态发育期间发挥着重要作用。E93既参与调控昆虫变态期间幼虫组织的细胞程序性死亡,同时也调控成虫组织器官的形成。但目前有关E93调控成虫组织器官形成的分子机制的研究还很少。E93最早在果蝇中被鉴定到,其在预蛹期和蛹期特异性表达;在蛹变态期,果蝇幼虫器官如唾液腺和中肠等发生凋亡,而翅原基却经历剧烈的形态变化过程最终发育为成虫的翅。基于蛹期翅的剧烈变态发育及成虫翅表型易于观察等优点,翅常作为研究器官发育的理想模型。在本研究中,我们以果蝇为模式生物探究了E93转录因子调控翅发育的分子机制。采用Gal4/UAS系统对果蝇E93基因进行翅特异性RNAi后观察表型,利用ChIP-seq数据分析筛选E93下游的潜在作用靶标,并通过在细胞及组织水平的分子生物学检测和个体水平的表型观察,最终解析了E93转录因子调控果蝇翅发育的分子机制。取得的主要研究结果如下:1.果蝇E93基因的翅特异RNAi对翅发育的影响为了探究果蝇翅中E93的表达对翅发育的影响,我们采用Gal4/UAS系统对果蝇E93基因进行翅特异性RNAi。本实验中共选用了4种果蝇翅特异性Gal4品系(nubbin-Gal4、MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4)和2种E93基因RNAi品系(V104390和#57868)。首先,利用Gal4/UAS系统检测了4种翅特异性Gal4在翅中的表达模式。通过将翅特异性Gal4品系的处女蝇分别与表达红色荧光蛋白的UAS-Cherry品系的雄蝇杂交,取其子代翅原基检测红色荧光蛋白的表达部位。结果显示,nubbin-Gal4驱动红色荧光蛋白在整个翅囊区表达;MS1096-Gal4驱动红色荧光蛋白在背区(D区)的翅囊区表达;en-Gal4和ptc-Gal4分别驱动红色荧光蛋白在翅原基后区(P区)和前区/后区(A/P)分界处表达。我们选取表达范围最广的nubbin-Gal4分别与果蝇E93基因的两种RNAi品系(V104390和#57868)及相应的对照品系进行杂交,并取其子代翅原基通过RT-PCR和qRT-PCR检测E93基因的表达。结果显示,与对照组相比,E93基因的翅特异性RNAi导致翅中E93的表达水平显著降低。表型观察和统计结果显示,果蝇E93基因的翅特异性RNAi引起成虫翅变小和翅脉发育异常,两组中E93基因RNAi后的翅面积分别减少了76.2%和82%。另外,我们利用MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4这三种翅特异性Gal4分别与E93基因RNAi品系V104390进行杂交,其子代同样表现出了翅变小和翅脉缺陷的表型。以上结果表明,E93在果蝇翅发育过程中发挥着极为重要的调控作用。2.基于ChIP-Seq数据筛选果蝇E93的潜在靶基因为了解析E93调控果蝇翅发育的分子机制,我们对果蝇E93在翅中的ChIP-seq数据进行了分析,以筛选E93的潜在靶基因。全基因组定位分析显示,28.51%的E93 ChIP峰位于基因启动子区(定义为转录起始位点上游2000bp的区域),共对应1868个基因;43.96%的E93 ChIP峰位于内含子区;13.65%的E93 ChIP峰位于基因间区。鉴于转录因子常通过与靶基因启动子区的关键DNA基序结合发挥其转录调控作用,我们重点关注了启动子区分布有E93 ChIP峰的1868个基因。GO功能注释显示,1868个基因中的513个基因富集于翅原基-翅变态这一生物学进程。进一步基于果蝇翅在蛹变态发育期的转录组数据,分析了这513个基因在化蛹后6 h、18h、24 h、36 h和44 h共五个时间点的翅中的协同表达变化。根据其不同的表达模式,共聚类为8个簇,其中E93基因位于簇2中,其表达变化趋势为在预蛹期开始逐渐上调表达,直至化蛹后24 h表达水平达到最高,而后表达又逐渐降低;513个基因中共有60个基因在蛹期具有和E93类似的表达模式。进一步对这60个基因进行KEGG通路富集分析,4条与翅发育相关的信号通路被富集,分别为:Dpp、MAPK、Notch和Hippo信号通路;4条信号通路中共富集到Dpp、Tkv、Sog、Nej、Numb、Ser、Wts、Baz、Kibra、Cka、Cic、Ttk共12个基因。3.果蝇E93调控翅发育的分子机制在基于ChIP-Seq数据筛选得到的果蝇E93的潜在靶基因中,我们注意到编码Dpp信号通路配体的Dpp基因被富集且在蛹期的表达变化与E93类似,鉴于Dpp信号通路在果蝇翅发育过程中的重要作用已有广泛报道,我们选择了Dpp基因作为E93的潜在靶基因进行了深入探究。通过果蝇基因组数据库FlyBase检索发现,果蝇Dpp基因共有4种亚型,分别为Dpp-RA、Dpp-RB、Dpp-RC和Dpp-RE。这4种亚型具有不同的启动子区,但经剪切加工后编码相同的蛋白产物。ChIP-Seq数据显示,在Dpp基因启动子区共存在6个E93 ChIP峰。Dpp-RA和Dpp-RB的启动子区各有两个峰,根据其距离转录起始位点的远近分别命名为Dpp-RA-D(D,远端)和Dpp-RA-P(P,近端)、Dpp-RB-D和Dpp-RB-P;在Dpp-RC和Dpp-RE的启动子区各有一个E93 ChIP峰。果蝇S2细胞中的ChIP-PCR实验结果表明,E93与Dpp启动子区的6个ChIP峰均能直接结合。我们利用荧光素酶报告基因实验分析了果蝇E93对Dpp启动子活性的调控作用。结果显示,E93过表达显著上调了Dpp-RA和Dpp-RC亚型启动子的活性,但对Dpp-RB和Dpp-RE亚型的启动子活性无显著影响。我们随后检测了E93对Dpp-RA和Dpp-RC亚型不同截短形式的启动子活性的影响,结果显示,E93过表达同样可诱导只含有近端ChIP峰的Dpp-RA启动子(Dpp-RA-P)的活性;但将Dpp-RA和Dpp-RC亚型启动子上的ChIP峰区域全部截除后,E93过表达对其启动子活性不再有显著影响。以上结果表明,E93可以与Dpp启动子直接结合并激活其启动子活性。我们进一步分析了果蝇E93基因的表达改变对Dpp信号通路基因转录的影响。qRT-PCR结果显示,nubbin-Gal4驱动的E93基因翅特异性RNAi导致翅中Dpp信号通路关键基因Dpp、Tkv和Mad的表达下调;在果蝇S2细胞中过表达E93则显著上调了Dpp、Tkv和Mad的表达。另外,免疫荧光结果显示,果蝇E93基因的翅特异性RNAi抑制了蛹期翅中Dpp的表达,并抑制了其对下游Mad的磷酸化和激活作用。我们还探究了Dpp信号通路基因表达改变对果蝇翅发育的影响。用果蝇翅特异的UAS-dicr2;nubbin-Gal4品系分别与Dpp、Tkv、Mad这三个Dpp信号通路关键基因的RNAi品系杂交,观察子代表型。与野生型果蝇的翅相比,对Dpp、Tkv、Mad基因的翅特异性RNAi均导致成虫翅显著减小和翅脉的缺失,这与E93基因翅特异性RNAi所导致的表型类似。综合分析表明,果蝇E93通过直接正调控Dpp信号通路关键基因影响了翅的发育。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q963
【部分图文】：

西南大学硕士学位论文空表达特征E93 基因存在 E93A 和 E93B 两种亚型，二者具期的 20E 滴度高峰诱导，E93A 和 E93B 在预，直至化蛹后 24 小时（h）其表达量达到最；在化蛹后 60h 时 E93 表达再次升高，直至而后又呈现降低趋势（图 1.2）。另外，在家究也表明，E93 具有在蛹期特异性高量表达的

图 1.3 E93 在果蝇不同组织中的表达[14]（30h APF） B.唾液腺（12h APF） C.胃盲肠（3h APF） D.马氏管（15h A.成虫中肠（21h APF） F-G.翅（36h APF） H-I.眼（39h APF） APF：化蛹Figure 1.3 Expression of E93 in different tissues of Drosophila[14] APF) B. salivary gland (12h APF) C. gastric caeca (3h APF) D. malpighian tubu midgut (21h APF) F-G.wing (36h APF) H-I.eye (39h APF) APF: after pupari转录因子的功能研究种转录因子，在昆虫中 E93 通过响应蜕皮激素信号继而调控时期特异性转录，在昆虫由蛹向成虫的变态发育过程中发挥道，在完全变态昆虫如果蝇和赤拟谷盗中，全身性干涉 E9期不能正常发育和分化形成成虫组织和器官，最终导致个另外，E93 在蛹期的多个组织中均有表达并发挥不同的调控功能的研究揭示了其在变态期间幼虫唾液腺和中肠等组织的重要的调控功能[10, 17]，并且参与调控昆虫变态发育期间脂

图 1.4 E93 在幼虫中肠细胞程序性死亡前表达[17]胃盲肠（三角箭头）；成虫中肠上皮细胞（箭头）A-D. 果蝇蛹壳形成后的 2h（A）、4h（B）、6h（C）、13h（D）的中肠。Figure 1.4 E93 protein is expressed in larval midguts prior to programmed cell death[1gastric caeca (arrowheads), adult midgut epithelia (arrows)A-D. Midgut at 2h (A), 4h (B), 6h (C), 13h (D) after puparium formation in Drosophila..2 E93 转录因子在果蝇唾液腺中的功能果蝇蛹壳形成约 10h 后再次出现 20E 滴度高峰，促进其由预蛹向蛹的3]。与中肠开始凋亡的时期不同，E93 响应蛹期出现的 20E 滴度高峰中开始表达并促进其凋亡[24]。研究表明，E93 可特异性结合在唾液腺的多个位点上，这些位点包括蜕皮激素诱导的基因如 E74 和 E75 等，序性细胞死亡相关的基因如 dredd、crq 等[17]。另外，在 E93 突变个体亡相关的基因如 rpr、hid 和 dronc 等的表达均出现了下调。因此，E93 应蜕皮激素信号并调控下游细胞凋亡基因的表达，进而调控变态期间
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本文编号：2886351