山葡萄苯丙烷代谢相关基因的克隆表达与功能验证

发布时间：2020-11-17 12:55

　　 山葡萄果皮中富含多种花色苷,该物质既能使植物呈现出诱人的色泽,又在各个领域中具有开发应用的潜能,对山葡萄花色苷的生物合成进行研究具有重要意义。本试验以不同发育期的山葡萄果皮为供试材料,针对控制花色苷生物合成的苯丙烷代谢途径,对参与该分支前三个催化反应步骤的PAL、C4H、4CL基因进行研究,应用RACE法获得了PAL、C4H、4CL基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR技术,对不同发育期的果皮中三个基因表达量进行分析;将目的基因在大肠杆菌中进行表达,并优化诱导表达过程;以拟南芥为受体材料,将C4H基因转化到拟南芥中。主要研究结果如下:从山葡萄果皮中克隆得到PAL、C4H、基因全长cDNA序列。分析结果显示:PAL基因VaPAL的全长eDNA为2 130 bp,开放阅读框(ORF)为1 926 bp,共编码641个氨基酸,分子量为61.06 KDa。C4H基因VaC4H的全长cDNA为1735 bp,开放阅读框(ORF)为1 518 bp,共编码505个氨基酸,分子量为57.70 KDa。4CL基因Va4WCL 的 cDNA 全长为 1 772 bp,放阅读框(ORF)为 1 635 bp,共编码544个氨基酸,分子量为61.07 KDa。研究山葡萄果皮不同发育阶段中PAL、C4H、4CL基因的表达规律,结果表明:VaPAL基因从转色前到完熟期表达量逐次递减,转色50%和转色 100%儿乎不表达。VaC4H在果皮各个转色时期表达丰度较高,该基因表达量在整个生长过程中表达量呈逐渐上升的趋势。在山葡萄果皮颜色转色100%时,Va4CL的表达丰度最高,在此阶段前该基因表达量呈逐渐上升的趋势,完熟时期表达有所下降,相对表达量在这三个基因中最低。将重组质粒pET28a-VaPAL、pET28a-VaC4H、pET28a-Va4CL转化感受态细胞BL21后,加入1PTG诱导菌体表达。本研究中,在28℃培养条件下筛选IPTG的浓度,PAL、C4H、4CL蛋白的IPTG最佳诱导浓度分别为1.0 mmol L-1、1.0 mmo丨L-1、1.2mmol-L,分子量分别约为 61 kDa、57kDa、61 kDa。转VaC4H基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株较野生型生长迅速,表现为叶片数目多于对照,中部叶片、叶柄均长于对照,茎和叶均有明显颜色变化,茎和叶颜色较深,呈现紫红色。
【学位单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S663.1;Q943.2
【部分图文】：

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【参考文献】

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本文编号：2887519