革兰氏阳性菌RNA降解关键酶的结构与功能研究

发布时间：2020-11-18 08:08

　　 RNA降解体是rRNA成熟和mRNA降解过程中一个重要的酶复合体,主要由核糖核酸酶、RNA解旋酶及糖酵解酶组成。其中参与RNA降解的关键核糖核糖酸酶包括RNase E、RNase Y以及RNase J。RNase E介导了大肠杆菌等革兰氏阴性菌的RNA加工过程;RNase Y和RNase J则在革兰氏阳性菌RNA加工过程中起着至关重要的作用。研究表明RNase Y是RNase E的同功蛋白,为革兰氏阳性菌RNA降解体中的支架蛋白。RNase Y的缺失将导致革兰氏阳性菌生长速率的减慢,并同时影响细胞形态、孢子形成以及抗生素的敏感性等,与细胞中毒性基因的表达调控相关。此外,革兰氏阳性菌的RNA降解过程还依赖于RNase J核糖核酸酶,其具有核酸内切酶及5'-3'核酸外切酶活性。RNase J为酿脓链球菌生长所必需,然而其在枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌中却能够完全被敲除。关于革兰氏阳性菌中RNA降解的具体机制目前尚不清楚。本文成功地解析获得了耐辐射奇球菌RNase J(DraRNase J)与UMP及DraRNase J活性缺失点突变蛋白与6nt RNA复合体的高分辨率晶体结构并进行了相应的生化实验验证。结果表明RNase J属于β-CASP亚家族蛋白,具有保守的双金属离子(锌离子)催化反应,其活性中心的两个Zn离子介导了 OH·对RNA磷酸二酯键的亲核攻击。RNaseJ中还存有一个保守的基序,能够特异性的识别底物RNA的5'端磷酸基团,决定了其核糖核酸外切酶活性的方向性;同时,Mn离子介导了该蛋白二聚化的过程,调控了 RNase J的核酸内切酶/外切酶的活性转换。这些研究成果揭示了革兰氏阳性菌RNA成熟关键酶RNase J蛋白的催化和活性转换机制,并首次为细胞内高浓度锰离子调控RNA代谢相关酶活性提供了直接证据。此外,本文研究表明耐辐射奇球菌rnj全长基因及其C末端为细胞生长所必须,该基因的杂合突变子将导致耐辐射奇球菌生长速率减慢以及环境胁迫适应性的降低。RNase Y能够与RNase J在内的多种RNA降解体相关组分相互作用。本文在耐辐射奇球菌中敲除了编码RNase Y蛋白的my基因,并获得了纯合突变株。进一步的研究表明该突变株能够极大的敲低耐辐射奇球菌rnj基因的拷贝数,造成耐辐射奇球菌生长速率的减缓,并且显著影响其所具有的极端抗性。RNA-seq转录组测序分析结果表明rny的缺失将导致耐辐射奇球菌中代谢相关途径,离子转运相关途径以及DNA损伤响应相关蛋白转录本的富集,进一步导致耐辐射奇球菌基因组稳定性降低。此外,通过比较野生株和突变株的转录组数据,筛选出了一系列潜在的RNaseY相关操纵子,为后续的研究提供了思路。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q935
【部分图文】：

ＤＲ是一种常温好氧型，不产生孢子，非运动型的非病原性细菌［５＿７】，在丰富??培养基中最适生长温度是３０°Ｃ［８］。固体培养基上培养的ＤＲ菌落外围呈圆球形，??表面光滑（如图１．１Ａ）。在透射电子显微镜和扫描电子显微镜下观察，发现ＤＲ??的细胞外形呈球状，直径约为ｌ？２ｐｍ?（如图１．１Ｂ）。通常，ＤＲ在生长的早期阶??段以二联体形式存在，在生长的后期阶段，以四联体形式存在［５］，图１．１Ｂ中分别??显示了?ＤＲ不同生长期的不同存在形式。ＤＲ的细胞壁具有较厚的肽聚糖层和外??外膜，在革兰氏染色中呈阳性，是一种革兰氏阳性菌［９］。培养ＤＲ通常使用ＴＧＹ??培养基（０．５?％?Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．３?％?Ｙｅａｓｔ?ｅｘｔｒａｃｔ、０？?１?％?Ｇｌｕｃｏｓｅ）?［１０］，培养温度为?３０＿３２°Ｃ??［８］，其在对数生长期，细胞繁殖一代的周期大约为一小时。??Ｉ??

１＿??Ｓ］＆０ｄ０??图１．１?ＤＲ的菌落形态及显微结构图Ａ．?ＤＲ的菌落形态；Ｂ．不同生长期的ＤＲ显微结??构图??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ．?Ａ．?Ｃｏｌｏｎｙ?ｐｉｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ?；??Ｂ．?Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ?ａｔ?ｅａｒｌｙ?ｇｒｏｗｔｈ?ｐｈａｓｅ?（ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｉ）?ａｎｄ?ｌａｔｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｐｈａｓｅ?（ｔｅｔｒａｃｏｃｃｉ）．?Ｔｈｅ?ｓｃａｌｅ??ｂａｒ?ｉｓ?０．５?｜．ｕｎ＂＇－１２ｌ??Ｄｅｗｏｃｏｃｃｃｆｃｅａｅ科的细菌通常具有超强的ＩＩ射抗性。ＤＲ因其极强的电离福射??抗性广为人知，并且它能够在多种极端条件下如干燥、高强度紫外线（ＵＶ）、严??寒、酸性等环境中存活，被誉为“世界上最顽强的细菌”，并且因其作为研究电??离辐射抗性的模式生物，是目前研究较多的极端微生物之一［８］。??１．１．３耐辐射奇球菌的基因组组成??１９９９年Ｏｗｅｎ?Ｗｈｉｔｅ等人完成了?ＤＲ的基因组测序工作。ＤＲ的基因组由两个??大小分别为２，６４８，６３８个碱基对的染色体Ｉ和４１２，３４８个碱基对的染色体丨Ｉ以及两??个大小分别为１７７，４６６个碱基对和４５，７０４个碱基对的质粒组成如图Ｕ所示）。??该基因组包含３１８７个开放阅读框（ＯＲＦ），平均大小为９３７ｂｐ，占基因组的９１％??（如表１．１所不）。系统发育研究表明，Ｚ）ｅ／＞７〇ｃｏｃｃ７＇属与属的细菌可能??具有共同的祖先［｜４］。通常

比如ＲｃｃＡ、ＰｐｒＡ等。ＰｐｒＩ的切割使得ＤｄｒＯ对ＤＮＡ损伤压力响应基??因的抑制解除，从而启动ＤＮＡ损伤修复途径。损伤修复后，ＤｄｒＯ重新结合于启??动子，细胞重新回到正常生长状态［１９］。图１．４比较了典型ＳＯＳ修复途径和ＤＲ中??Ｐｐｒｌ／ＤｄｒＯ介导的ＤＮＡ损伤响应系统。??Ｃｌａｓｓｉｃ?ＳＯＳ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?Ｎｏｖｅｌ?ＤＮＡ?ｄａｍａｇｅ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ??——？?ｓｏｓ?ＧＥＮＥＳ１＝?￣￣－?＾ｊｐｐＲＧ＾ＥｓＩｒ＾＾ｒ??〇〇Ｓ°〇?＋?＾?＜?闷?ｙ??ＲｅｃＡ－ｓｓＯＮＡ＾?＾?ＤＮＡ?ｄａｍａｇｅ?＾?ＤＮＡ?ｄａｍａｇｅ??１?心?Ａ?，???，?，??—￣［ｓｏｓ?ｇｅｎｅｓ?［：?—?■?｜ｄｄｒ?ｇｅｎｅｓ?ｐｚ?＇??。。?ＣＪ?＾?＇＿／—＾??Ａｕｔｏ－ｃｉｅａｖａｇｅ?（?Ｓｐｅａｋ?ｃｌｅａｖａｇｅ?Ｃ??＾ＲＮＡＰ＾ｊ?｜?ＳＯＳ?ＧＥＮＥＳ?｜Ｚ?￣?＝?｜????ｒｅｐａｉｒｅｄ?Ｈｒｄｒｍ?ｓｉｔｅ?ｒｅｐａｉｒｅｄ??图１．４大肠杆菌中经典ＳＯＳ修复系统与ＤＲ中Ｐｐｒｌ／ＤｄｒＯ介导的ＤＮＡ损伤修复系统的??比较??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｃｌａｓｓｉｃ?ＳＯＳ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｓｙｓｔｅｒｍ?ｉｎ?
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本文编号：2888507