星星草（Puccinellia tenuiflora）DREPPs基因克隆及功能解析

发布时间：2020-11-20 19:02

　　 发育调节质膜多肽(DREPP)是一类与质膜相关的植物特异性蛋白,具有结合磷脂酰肌醇磷酸盐(PtdInsPs)、Ca2+/钙调蛋白(CaM)、微管和微丝等功能,在植物生长发育与逆境应答过程中发挥了重要作用。DREPP应答低温、干旱等逆境的分子机制已有研究,但是其盐碱应答分子机理尚未见报道。本研究以星星草(Puccinellia tenuiflora 为实验材料,在全基因组范围内分析了 PutDREPP家族组成,并克隆了PutDREPP1和PutDREPP2基因。进而利用生物化学和分子遗传学策略分析了PutDREPP1和PutDREPP2基因表达特性、蛋白质亚细胞定位,及其与Ca2+/CaM的结合能力,并通过分析PutDREPP1过表达拟南芥植株初步解析了其在逆境应答过程中的生物学功能。我们利用新近获得的星星草全基因组数据库,分析了PutDREPP基因家族组成,包括PutDREPP1和PutDREPP2,并克隆到PutDREPP1和PutDREPP2基因。生物信息学分析表明,PutDREPP1 ORF区域长度为609 bp,编码202个氨基酸;PutDREPP2 ORF区域长度为651 bp,编码216个氨基酸。PutDREPP1和PutDREPP2均具有DREPP家族蛋白功能结构域。星星草PutDREPP1和PutDREPP2分别与水稻(Oryza sativa)的OsDREPP1和OsDREPP2同源性最高。我们利用实时荧光定量PCR技术检测到PutDREPP1与PutDREPP2在星星草的根、茎、叶、花、叶鞘、花穗、花柄以及种子中均有表达。PutDREPP1在根中表达量最高,花穗中表达量最低。PutDREPP2在种子中表达量最高,叶中表达量最低;在75 mmol/L Na2CO3、100 mmol/L NaHCO3、200 mmo1/L NaCl、10 mmol/L H2O2、160 μmol/L CdCl2 以及 4℃胁迫时,除了根中的PutDREPP1在低温胁迫时受抑制表达,其余胁迫条件下叶和根中的PutDREPP1都受诱导表达。而根和叶中的PutDREPP2在100 mmol/LNaHCO3、200 mmol/L NaCl、160μmol/L CdCl2以及4℃时都受抑制表达。这暗示着PutDREPPs可能参与了盐碱、重金属、过氧化氢以及低温等胁迫的应答过程。通过构建pBI121-PutDREPP1-GFP和pBI121-PutDREPP2-GFP载体,并分别导入烟草(Nicotiana tabacum)叶片细胞和洋葱(Allium cepa)表皮细胞中进行瞬时表达,亚细胞定位结果表明,正常条件下PutDREPP1和PutDREPP2主要定位于质膜。通过PutDREPPs基因原核表达体系,诱导并纯化到His-PutDREPP1和His-PutDREPP2融合蛋白,经蛋白免疫印迹法验证了蛋白质纯度,并利用Ca2+/CaM结合实验初步证实了 PutDREPPs具有Ca2+/CaM结合能力。通过构建过表达PutDREPP1和PutDREPP2基因植物载体,并利用农杆菌侵染法分别获得过表达PutDREPP1和PuuDREPP2基因拟南芥植株。对过表达PutDREPP1基因拟南芥植株的耐盐性进行分析。在100 mmol/L和125 mmol/LNaCl胁迫下,过表达PutDREPP1基因拟南芥的根长和鲜重都优于野生型拟南芥。这表明PutDREPP1可能对盐应答具有正调控作用。我们的研究结果为深入认识DREPPs调控逆境应答的分子机制,以及进一步研究星星草等盐生植物盐碱应答分子机理提供了新的信息。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

?基因的克隆与表达特性分析??３．１．１?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ?＾（＼?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??利用ＲＮＡ提取试剂盒提取星星草根和叶片的总ＲＮＡ，电泳检测目的条带（图３－１）。??如图所示，２８Ｓ?ｒＲＮＡ和１８Ｓ?ｒＲＮＡ均有清晰条带，且２８Ｓ?ｒＲＮＡ条带亮度大致为１８Ｓ??ｒＲＮＡ的２倍，表明所提ＲＮＡ质量良好，可进行接下来的实验。??１?２??图３－１星星草总ＲＮＡ提取电泳图??１：根中的ＲＮＡ；?２：叶片中的ＲＮＡ??Ｆｉｇ．?３－１?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ?ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ??１：?Ｒｏｏｔ?ｏｆ?ＲＮＡ；?２：?Ｌｅａｆ?ｏｆ?ＲＮＡ??将提取到的星星草根和叶片的总ＲＮＡ，利用反转录试剂盒反转录成ｃＤＮＡ。以叶片??的ｃＤＮＡ为模板，基因特异性引物，进行ＰＣＲ扩增，电泳检测到在７００?ｂｐ左右有目的??性特异条带（图３－２）。将目的条带胶回收，连接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ载体上，转至大肠杆菌??．ＩＭ１０９上，挑取单克隆摇菌，送公司测序。序列正确的菌液提取质粒，进行双酶切鉴定??（图３－３），条带与基因大小相符，分别命名为ｐＥＡＳＹ－Ｂ

时期的不同器官，提取总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ为模板，以为内参基因，采用实时??荧光定量ＰＣＲ技术分析尸ｗ／Ｚ）狀ＰＰ／、在星星草不同器官中的表达特性。??如图３－８所示，在星星草根、花、种子中的表达量较高，而在花穗和花??柄中的表达量较低，但表达量差异不大。在星星草种子中的表达量约是叶中??表达量的１８倍，其表达量最高，其次是在茎中，在叶中的表达量最低。??ａ?＞－５?ｂ?４０??３５．??３．０?■??？?１０?丄?丨?室??ｓ?ｉ?１?－ｅ２－５?■??ＳＩ?，，?丄「１?Ｓｈｏ?．??ｓｉ?丄?ｆ?上?ｎ?．．?２．ｓ?ｘ．??＝ｉ〇，?．?［ｔｉ?ｒｉ?［＾１?ｖ?ｗｒ．?？?Ｔ?丄??Ｔ?Ａ由?ｉ〇?－ｎ?丄ｉ内ｍ??１?内人．．．??０．０?￣Ｌ—＾￣＊—ｌ—１￣■—＊—１￣１￣￣￣￣Ｌ－＊—Ｊ￣００??ｍ?茎?叶珀花穗花柄?花种子?根茎叶?鞀?花穗花柄花?拧子??胁迫时间?胁迫时间??Ｓｔｒｅｓｓ?ｔｉｍｅ?Ｓｔｒｅｓｓ?ｔｉｍｅ??图３－８?Ｐｗ／Ｚ）／？五／ＶＶ和／基因在星星草不同器官中的表达特性分析??ａ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ；?ｂ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??Ｆｉｇ．?３－８?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ?ａｎｄ?Ｐｕ（ＤＲＥＰＰ２?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｏｒｇａｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ??ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ??ａ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ；?ｂ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??３．２?ＰｕｔＤＲＥＰＰｓ的亚细胞定位??为观察ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ和ＰｕｔＤＲＥＰＰ２的亚细胞定位

??图３－１０?ｐＢｉｍ－Ｚ＾／＾ＥＰ／＾－ＧＦＰ重组质粒的酶切鉴定??Ｍ：?ＤＬ１５０００；?１：?ｐＢｉｍ－Ｐｗ／Ｄｉ＾Ｗ－ＧＦＰ?的酶切鉴定?Ｃ％ａＩ／＆７／Ｉ）；?２：?ｐＢｉｍ－Ｐｗ／Ｄ／ｅｆＰ尸２－ＧＦＰ??的酶切鉴定ＣＷａＩ／＆ｃＩ）??Ｆｉｇ．?３－１０?Ｅｍｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＢｌ＼２ｌ－ＰｕｔＤＲＥＰＰ２－Ｇ￥Ｐ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ：?ＤＬ１５０００；?１：?ｐＢＩｌ?２?ｌ－／＞ｗ／Ｄ７＾￡，／＞Ｐ２－ＧＦＰ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅｓ?（Ｘｂａ?＼／Ｓａｌ＼）；?２：?ｐＢ＼＼２＼－ＰｕｆＤＲＥＰＰ２－ＧＦ？??ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅｓ?（Ｘｂａ?ＭＳａｃ?Ｉ）??３０??
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本文编号：2891852