铜绿假单胞菌中c-di-GMP代谢酶PA0575对Ⅲ型分泌系统及生物被膜形成的特异性调控机制研究
发布时间：2021-02-20 21:10
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是条件致病菌,可引起多种急慢性感染。其急性感染主要依赖于细菌运动和Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system,T3SS）,而慢性感染通常与生物被膜的形成有关。在铜绿假单胞菌中,Gac/Rsm通路已被证明参与调节细菌从急性感染到慢性感染的转换过程。除Gac/Rsm通路外,细胞内的第二信使环二鸟苷酸（cyclic di-GMP,c-di-GMP）在这一转换过程中同样发挥着关键的调控作用。研究表明,铜绿假单胞菌基因组上编码多个二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶,它们负责cdi-GMP的合成和降解,但这些酶如何实现信号转导的特异性仍不清楚。实验室前期研究发现,含有GGDEF和EAL结构域的杂合c-di-GMP代谢酶PA0575的缺失可在不同时期显著影响细菌生物被膜的形成。同时PA0575的缺失可上调T3SS的表达,过表达PA0575则严重降低了T3SS的表达。我们推测,PA0575可能是调控铜绿假单胞菌急慢性感染过程中的关键调节因子。为了进一步阐明PA0575在铜绿假单胞菌急慢性感染过程中的具体功能及调控机制,我们对PA0575...
【文章来源】：西北大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Ⅲ型分泌系统的结构和调控模型[54]
第一章绪论5调控系统（图1）。在cAMP途径中，铜绿假单胞菌外部环境中的低浓度的钙离子诱导细胞内cAMP的增加，导致T3SS基因高水平的表达[61]。在Gac/Rsm系统中，LadS通过一系列磷酸化的级联反应的方式激活Gac/Rsm系统（图2），在慢性感染期间下调T3SS的表达[62-65]。而RetS通过与GacS结合形成异源二聚体，阻止了GacS自身的磷酸化，此时GacA下游直接调控的两个microRNA（RsmY/RsmZ）转录水平降低，解除对结合蛋白RsmA的负调控。RsmA则间接正调T3SS基因的表达，同时负调生物被膜形成基因的表达及Ⅵ型分泌系统毒性因子的分泌[66]。MoscosoJA等人的研究显示，在retS突变体中，c-di-GMP水平的升高导致T3SS表达的降低，同时上调Ⅵ型分泌系统（typeⅥsecretionsystem，T6SS）的表达以及生物被膜的形成[67]。此外Gac/Rsm系统可通过调控二鸟苷酸环化酶SadC的表达水平来发挥对生物被膜的部分调控作用[45]。以上这些研究表明，c-di-GMP信号途径和Gac/Rsm系统可协同调控铜绿假单胞菌的急慢性感染转换过程。除此之外，铜绿假单胞菌T3SS基因表达还受到多种因素的调节，比如代谢效应、DNA损伤、细胞外高浓度的Cu2+，低渗透压等[68]。图2铜绿假单胞菌生活方式调节示意图[67]Fig.2SchematicdiagramoflifestyleregulationofPseudomonasaeruginosa尽管有关Ⅲ型分泌系统的组成和调控机制的研究取得了很多的成果，但是目前还是存在一些疑问。在Ⅲ型分泌系统的组成中，针状复合体是最重要的组成部分，目前还不清楚细菌是如何控制这种针状复合体延伸到适当的长度。如果针头太短，它就不能穿过宿主细胞外膜上的脂多糖（LPS）层；如果针头太长，输送效应蛋白的效率可能会降低
西北大学硕士学位论文22ddH2O6.6μL（3）对PCR产物进行消甲基化，37℃反应1-2h，反应体系：DpnⅠ0.2μLPCR产物10μL（4）去甲基化反应后，将产物化学转化至大肠杆菌DH5α。（5）挑取长出的单克隆纯化，提取质粒，进行测序分析。确定突变位点正确后，将定点突变后的重组质粒分别命名为：pAK-0575ΔGGDEF、pAK-0575ΔEAL。2.2.9启动子表达载体的构建本次实验基于已有的启动子报道质粒pMS402构建基因表达载体pKD-cbrB[73]，以下是详细的构建过程：图3质粒pMS402图谱Fig.3TheplasmidmapofpMS402以PAO1的全基因组为模板，使用pKD-cbrB-S/pKD-cbrB-AS引物，用Pfu酶对目的基因cbrB的启动子序列进行PCR扩增。最终插入到pMS402质粒上，经验证正确后就得到了正确的表达载体pKD-cbrB。通过电转的方法转入到铜绿假单胞菌中，检测该基因在转录水平的表达情况。除此之外，在重组构建好的pKD质粒中通过PacⅠ单酶切，与整合质粒Mini-CTX-lacZ中得到CTX6.1连接后，能够得到整合染色体上的报道载体，这样做可以保证报道
【参考文献】：
期刊论文
[1]铜绿假单胞菌生物被膜研究进展[J]. 高珊,张哲伦,苏杭,韩峰. 中国海洋药物. 2018(05)
博士论文
[1]铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统转录调控机制的研究[D]. 孔伟娜.西北大学 2013
本文编号：3043349
【文章来源】：西北大学陕西省 211工程院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Ⅲ型分泌系统的结构和调控模型[54]
第一章绪论5调控系统（图1）。在cAMP途径中，铜绿假单胞菌外部环境中的低浓度的钙离子诱导细胞内cAMP的增加，导致T3SS基因高水平的表达[61]。在Gac/Rsm系统中，LadS通过一系列磷酸化的级联反应的方式激活Gac/Rsm系统（图2），在慢性感染期间下调T3SS的表达[62-65]。而RetS通过与GacS结合形成异源二聚体，阻止了GacS自身的磷酸化，此时GacA下游直接调控的两个microRNA（RsmY/RsmZ）转录水平降低，解除对结合蛋白RsmA的负调控。RsmA则间接正调T3SS基因的表达，同时负调生物被膜形成基因的表达及Ⅵ型分泌系统毒性因子的分泌[66]。MoscosoJA等人的研究显示，在retS突变体中，c-di-GMP水平的升高导致T3SS表达的降低，同时上调Ⅵ型分泌系统（typeⅥsecretionsystem，T6SS）的表达以及生物被膜的形成[67]。此外Gac/Rsm系统可通过调控二鸟苷酸环化酶SadC的表达水平来发挥对生物被膜的部分调控作用[45]。以上这些研究表明，c-di-GMP信号途径和Gac/Rsm系统可协同调控铜绿假单胞菌的急慢性感染转换过程。除此之外，铜绿假单胞菌T3SS基因表达还受到多种因素的调节，比如代谢效应、DNA损伤、细胞外高浓度的Cu2+，低渗透压等[68]。图2铜绿假单胞菌生活方式调节示意图[67]Fig.2SchematicdiagramoflifestyleregulationofPseudomonasaeruginosa尽管有关Ⅲ型分泌系统的组成和调控机制的研究取得了很多的成果，但是目前还是存在一些疑问。在Ⅲ型分泌系统的组成中，针状复合体是最重要的组成部分，目前还不清楚细菌是如何控制这种针状复合体延伸到适当的长度。如果针头太短，它就不能穿过宿主细胞外膜上的脂多糖（LPS）层；如果针头太长，输送效应蛋白的效率可能会降低
西北大学硕士学位论文22ddH2O6.6μL（3）对PCR产物进行消甲基化，37℃反应1-2h，反应体系：DpnⅠ0.2μLPCR产物10μL（4）去甲基化反应后，将产物化学转化至大肠杆菌DH5α。（5）挑取长出的单克隆纯化，提取质粒，进行测序分析。确定突变位点正确后，将定点突变后的重组质粒分别命名为：pAK-0575ΔGGDEF、pAK-0575ΔEAL。2.2.9启动子表达载体的构建本次实验基于已有的启动子报道质粒pMS402构建基因表达载体pKD-cbrB[73]，以下是详细的构建过程：图3质粒pMS402图谱Fig.3TheplasmidmapofpMS402以PAO1的全基因组为模板，使用pKD-cbrB-S/pKD-cbrB-AS引物，用Pfu酶对目的基因cbrB的启动子序列进行PCR扩增。最终插入到pMS402质粒上，经验证正确后就得到了正确的表达载体pKD-cbrB。通过电转的方法转入到铜绿假单胞菌中，检测该基因在转录水平的表达情况。除此之外，在重组构建好的pKD质粒中通过PacⅠ单酶切，与整合质粒Mini-CTX-lacZ中得到CTX6.1连接后，能够得到整合染色体上的报道载体，这样做可以保证报道
【参考文献】：
期刊论文
[1]铜绿假单胞菌生物被膜研究进展[J]. 高珊,张哲伦,苏杭,韩峰. 中国海洋药物. 2018(05)
博士论文
[1]铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统转录调控机制的研究[D]. 孔伟娜.西北大学 2013
本文编号：3043349
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