鳞翅目昆虫基因编辑技术研究进展
发布时间：2021-03-04 00:07
鳞翅目昆虫种类繁多,遗传多样性极高,通过基因编辑对其基因功能进行研究,解析其遗传及生理生化调控机理是一种高效实用的方法。鳞翅目昆虫基因编辑技术主要有3种:锌指核酸酶（Zinc finger nucleases,ZFNs）技术、转录激活因子样效应蛋白核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases,TALENs）技术和CRISPR/Cas 技术,其原理是在基因组特定位点制造 DNA 双链断裂,从而激活机体自身的 DNA 损伤修复机制,在此过程中产生插入、删除等多种突变类型。就此3种主要基因编辑技术的原理及应用于重要鳞翅目昆虫如家蚕、斜纹夜蛾、棉铃虫等基因编辑研究进展进行简要综述,为鳞翅目昆虫功能基因组研究、昆虫生理生化、昆虫行为学研究及建立害虫绿色防控体系提供参考。最后,对基因编辑技术在鳞翅目昆虫中的应用现状做简要总结,对建立鳞翅目昆虫适用的基因编辑技术及应用前景进行展望。
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(03)北大核心
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
ZFNs结构及工作原理[5-6]
转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALENs)技术是第二代基因编辑技术,TALENs来源于植物病原菌黄单胞菌属(Xanthomonas),与ZFNs结构相似,每一个TALENs由两个功能域组成:N末端为TALE蛋白结构域,特异性的结合DNA序列,C端为FokⅠ核酸内切酶结构域,非特异的切割靶位点造成双链断裂。每个TALE蛋白由3个部分组成:N-端转运信号;C-端核定位信号NLSs及酸性转录激活结构域AD;中间DNA结合结构域。中间DNA结合结构域由多个串联排列的重复序列单元组成,单个重复序列单元由33-35个高度保守的氨基酸组成,其中第12和13位氨基酸可变,被称为重复可变双残基(Repeat-variable diresidue,RVD),RVD可特异的识别DNA碱基,其中NI识别A;NG识别T;HD识别C;NK识别G;NN识别G或A;NS识别A、C、G、T等,根据不同碱基序列设计相应的TALE模块串,理论上可以靶向任何序列[7-8](图2)。1989年,Bonas首次报道,2009年成功应用于植物细胞基因组编辑[7],迄今已应用于多种鳞翅目昆虫基因编辑研究(表1)。2012年,Ma等[9]首次尝试使用TALENs敲除家蚕BmBLOS2基因,通过显微注射的方法,成功获得BmBLOS2缺失突变个体。通过同时注射两对TALENs,切割靶序列的两个不同位点,实现了家蚕基因组长片段删除。为了提高其编辑效率,Takasu等[10]对TALENs系统进行了进一步的改造,利用改进的TALENs系统pBlueTAL对家蚕BmBLOS2和Bm-re基因进行敲除,编辑效率提高了一个数量级。2014年后,TALENs技术在家蚕基因编辑中的应用快速发展,Xu等[11]利用TALENs对家蚕性别分化相关基因Bmdsx基因雌性特异外显子进行敲除,获得了雌性不育遗传系。日本科学家Sakurai和Yang等[12-13]利用TALENs分别对家蚕和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)性信息素相关受体基因进行基因敲除,缺失相关受体的个体出现交配行为异常。为了提高突变的精确性,Ma等[14]将TALEN技术与ssODN联合注射到家蚕胚胎中,实现了家蚕染色体水平的精准靶向编辑,制备了染色体缺失、重复、倒位等多个染色体结构变异模型。将TALENs与微同源介导的末端连接原理结合,Nakade等[15]构建了TAL-PITCh编辑器,成功在家蚕BmBLOS2基因位点插入GFP,该系统极大地提高了基因体内标记示踪效率。迄今,利用上述TAL-PITCh编辑器已成功建立了家蚕W染色体示踪品系及雌性W染色体特异表达Cas9稳定遗传品系[16]。TALENs技术的快速发展及广泛应用极大地推动了鳞翅目昆虫基因编辑研究进展。3 CRISPR/Cas技术及鳞翅目昆虫基因编辑应用
CRISPR/Cas基因编辑技术是第三代基因编辑技术,不同于前两代技术,它是一种由RNA引导的核酸内切酶技术,是细菌和古细菌为应对外源核酸物质攻击所演化而来的获得性免疫防御机制,由两部分组成:CRISPR即规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),由前导序列(Leader)、重复序列(Repeat)和间隔序列(Spacer)组成;Cas 即 CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated system),其编码核酸切割相关蛋白酶(图3-A)。CRISPR/Cas免疫防御包括3个阶段:接受(Adaptation),pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)表达和加工,干扰(图3-B)。接受阶段:外源核酸物质首次入侵细菌基因组时,CRISPR系统会识别外源核酸中的PAM序列(Protospacer adjacent motif,原间隔序列临近基序),并将其上游约 30 nt 的序列(原间隔序列Protospacer)剪切后插入自身CRISPR 阵列中的两段重复序列之间(Repeat),形成新的 Spacer,获得免疫记忆。pre-crRNA合成与加工阶段:当外源核酸物质再次入侵细菌基因组时,在前导序列(Leader)的作用下起始转录CRISPR,得到的初级转录产物CRISPR RNA(Pre-crRNA)在相关Cas核酸酶的作用下被加工成成熟的crRNA。干扰阶段:成熟的crRNA 与相关 Cas 蛋白形成复合体,通过碱基互补配对,crRNA识别外源核酸物质中protospacer序列,引导Cas蛋白复合物对外源核酸进行切割,造成双链断裂,从而防止外源核酸入侵[20-21]。95%的古细菌及48%的细菌其基因组中至少存在一个CRISPR基因座,具有极高的物种特异性和多样性,不同菌种识别的PAM序列和Cas蛋白的数量及类型不同。基于Cas蛋白结构及进化关系CRISPR/Cas系统可分为2个大类、6种类型及多种亚型(图3),其中应用较为广泛的有Cas3(Type I)、Cas9(Type II)、Cas10(Type III)、Csf1(Type IV)、Cpf1/Cas12(Type V)、Cas13(Type VI)[20-22]。2012年,Jinek等[23]首次证明改造后的CRISPR/Cas系统可以用于DNA体外靶向切割。Cas9 是Cas蛋白中重要的一员,CRISPR/Cas9 基因编辑系统是细菌II型获得性免疫防御系统经人工改造而成,由Cas9蛋白、pre-crRNA(cr-RNA前体)和tracrRNA(Trans-activating crRNA)3个组分组成,pre-crRNA与tracrRNA结合,经加工成成熟的发夹结构cr-RNA;cr-RNA通过互补配对的方式引导 Cas9 蛋白对靶序列进行切割,造成DNA双链断裂,启动DNA损伤修复机制,在双链切口位点附近造成删除、插入等多种随机突变。
本文编号：3062192
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(03)北大核心
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
ZFNs结构及工作原理[5-6]
转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALENs)技术是第二代基因编辑技术,TALENs来源于植物病原菌黄单胞菌属(Xanthomonas),与ZFNs结构相似,每一个TALENs由两个功能域组成:N末端为TALE蛋白结构域,特异性的结合DNA序列,C端为FokⅠ核酸内切酶结构域,非特异的切割靶位点造成双链断裂。每个TALE蛋白由3个部分组成:N-端转运信号;C-端核定位信号NLSs及酸性转录激活结构域AD;中间DNA结合结构域。中间DNA结合结构域由多个串联排列的重复序列单元组成,单个重复序列单元由33-35个高度保守的氨基酸组成,其中第12和13位氨基酸可变,被称为重复可变双残基(Repeat-variable diresidue,RVD),RVD可特异的识别DNA碱基,其中NI识别A;NG识别T;HD识别C;NK识别G;NN识别G或A;NS识别A、C、G、T等,根据不同碱基序列设计相应的TALE模块串,理论上可以靶向任何序列[7-8](图2)。1989年,Bonas首次报道,2009年成功应用于植物细胞基因组编辑[7],迄今已应用于多种鳞翅目昆虫基因编辑研究(表1)。2012年,Ma等[9]首次尝试使用TALENs敲除家蚕BmBLOS2基因,通过显微注射的方法,成功获得BmBLOS2缺失突变个体。通过同时注射两对TALENs,切割靶序列的两个不同位点,实现了家蚕基因组长片段删除。为了提高其编辑效率,Takasu等[10]对TALENs系统进行了进一步的改造,利用改进的TALENs系统pBlueTAL对家蚕BmBLOS2和Bm-re基因进行敲除,编辑效率提高了一个数量级。2014年后,TALENs技术在家蚕基因编辑中的应用快速发展,Xu等[11]利用TALENs对家蚕性别分化相关基因Bmdsx基因雌性特异外显子进行敲除,获得了雌性不育遗传系。日本科学家Sakurai和Yang等[12-13]利用TALENs分别对家蚕和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)性信息素相关受体基因进行基因敲除,缺失相关受体的个体出现交配行为异常。为了提高突变的精确性,Ma等[14]将TALEN技术与ssODN联合注射到家蚕胚胎中,实现了家蚕染色体水平的精准靶向编辑,制备了染色体缺失、重复、倒位等多个染色体结构变异模型。将TALENs与微同源介导的末端连接原理结合,Nakade等[15]构建了TAL-PITCh编辑器,成功在家蚕BmBLOS2基因位点插入GFP,该系统极大地提高了基因体内标记示踪效率。迄今,利用上述TAL-PITCh编辑器已成功建立了家蚕W染色体示踪品系及雌性W染色体特异表达Cas9稳定遗传品系[16]。TALENs技术的快速发展及广泛应用极大地推动了鳞翅目昆虫基因编辑研究进展。3 CRISPR/Cas技术及鳞翅目昆虫基因编辑应用
CRISPR/Cas基因编辑技术是第三代基因编辑技术,不同于前两代技术,它是一种由RNA引导的核酸内切酶技术,是细菌和古细菌为应对外源核酸物质攻击所演化而来的获得性免疫防御机制,由两部分组成:CRISPR即规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),由前导序列(Leader)、重复序列(Repeat)和间隔序列(Spacer)组成;Cas 即 CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated system),其编码核酸切割相关蛋白酶(图3-A)。CRISPR/Cas免疫防御包括3个阶段:接受(Adaptation),pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)表达和加工,干扰(图3-B)。接受阶段:外源核酸物质首次入侵细菌基因组时,CRISPR系统会识别外源核酸中的PAM序列(Protospacer adjacent motif,原间隔序列临近基序),并将其上游约 30 nt 的序列(原间隔序列Protospacer)剪切后插入自身CRISPR 阵列中的两段重复序列之间(Repeat),形成新的 Spacer,获得免疫记忆。pre-crRNA合成与加工阶段:当外源核酸物质再次入侵细菌基因组时,在前导序列(Leader)的作用下起始转录CRISPR,得到的初级转录产物CRISPR RNA(Pre-crRNA)在相关Cas核酸酶的作用下被加工成成熟的crRNA。干扰阶段:成熟的crRNA 与相关 Cas 蛋白形成复合体,通过碱基互补配对,crRNA识别外源核酸物质中protospacer序列,引导Cas蛋白复合物对外源核酸进行切割,造成双链断裂,从而防止外源核酸入侵[20-21]。95%的古细菌及48%的细菌其基因组中至少存在一个CRISPR基因座,具有极高的物种特异性和多样性,不同菌种识别的PAM序列和Cas蛋白的数量及类型不同。基于Cas蛋白结构及进化关系CRISPR/Cas系统可分为2个大类、6种类型及多种亚型(图3),其中应用较为广泛的有Cas3(Type I)、Cas9(Type II)、Cas10(Type III)、Csf1(Type IV)、Cpf1/Cas12(Type V)、Cas13(Type VI)[20-22]。2012年,Jinek等[23]首次证明改造后的CRISPR/Cas系统可以用于DNA体外靶向切割。Cas9 是Cas蛋白中重要的一员,CRISPR/Cas9 基因编辑系统是细菌II型获得性免疫防御系统经人工改造而成,由Cas9蛋白、pre-crRNA(cr-RNA前体)和tracrRNA(Trans-activating crRNA)3个组分组成,pre-crRNA与tracrRNA结合,经加工成成熟的发夹结构cr-RNA;cr-RNA通过互补配对的方式引导 Cas9 蛋白对靶序列进行切割,造成DNA双链断裂,启动DNA损伤修复机制,在双链切口位点附近造成删除、插入等多种随机突变。
本文编号：3062192
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