基于新的CRISPR/Cas9技术实现斑马鱼LHX9基因的快速编辑及对F0突变体性腺发育的初筛
发布时间：2021-03-07 17:54
目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变...
【文章来源】：现代生物医学进展. 2020,20(01)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
四条sg RNA靶位点位置图。
本项研究利用新的CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过对斑马鱼胚胎同时注射四条针对某一靶基因的sg RNA，足以产生基因敲除效应，实现在F0代获得与纯合F2代变异体相似的临床表型。根据相关研究报道，这项新的CRISPR/Cas9基因打靶技术，基因敲除效率可达90%以上，产生几乎完全外显的表型，且毒性作用不明显（胚胎畸形率<17%)[1]。不同基因的g RNA往往由于染色体结构不同、未注释的SNP、改变的起始位点或剪切位点等因素产生不同的靶向效率。有时，即便能够靶向到特定的基因，非同源修复也会导致出现部分功能的等位基因而影响敲除效率[13]。与传统的设计一条sg RNA进行打靶相比，这种方法使F0的敲除表型（null phenotype）接近纯合F2代。此项技术可以在短期内获得与F2纯合表型接近的变异体，在对未知功能基因进行筛选中有及其广泛的应用前景。本项研究就是利用该技术，对VASA转基因斑马鱼进行了LHX9的基因敲除，以探究LHX9基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。哺乳动物的性腺发育开始于早期具有双向分化潜能的性腺原基，在睾丸决定因子SRY基因的调控下，性腺原基发育成睾丸，分泌雄激素与抗缪勒试管激素，促使胚胎的雄性化发育，相反的，缺乏SRY基因的个体，胚胎发育则会向雌性化方向进行[14,15]。这个过程中参与的基因目前已知的主要有SRY,SF1,SOX9[16]等。而LHX9作为LIM同源家族的转录因子，目前所广为人知的功能主要是参与了神经系统的发育，其在性腺发育过程中的研究并没有被深入。有趣的是，2000年，birk[2]等在小鼠胚胎发育早期的泌尿生殖嵴中发现了LHX9基因的广泛分布，而原始生殖细胞正是在泌尿生殖嵴处形成。进一步观察发现，LHX9可调控类固醇生成因子（SF-1）的表达；在敲除LHX9的小鼠体内，性腺体细胞出现增殖障碍，雄性小鼠出现外生殖器的雌性化改变，提示该基因在性腺发育中起重要作用。
哺乳动物的性腺发育开始于早期具有双向分化潜能的性腺原基，在睾丸决定因子SRY基因的调控下，性腺原基发育成睾丸，分泌雄激素与抗缪勒试管激素，促使胚胎的雄性化发育，相反的，缺乏SRY基因的个体，胚胎发育则会向雌性化方向进行[14,15]。这个过程中参与的基因目前已知的主要有SRY,SF1,SOX9[16]等。而LHX9作为LIM同源家族的转录因子，目前所广为人知的功能主要是参与了神经系统的发育，其在性腺发育过程中的研究并没有被深入。有趣的是，2000年，birk[2]等在小鼠胚胎发育早期的泌尿生殖嵴中发现了LHX9基因的广泛分布，而原始生殖细胞正是在泌尿生殖嵴处形成。进一步观察发现，LHX9可调控类固醇生成因子（SF-1）的表达；在敲除LHX9的小鼠体内，性腺体细胞出现增殖障碍，雄性小鼠出现外生殖器的雌性化改变，提示该基因在性腺发育中起重要作用。图4 胚胎发育6d的VASA转基因斑马鱼荧光成像。
本文编号：3069551
【文章来源】：现代生物医学进展. 2020,20(01)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
四条sg RNA靶位点位置图。
本项研究利用新的CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过对斑马鱼胚胎同时注射四条针对某一靶基因的sg RNA，足以产生基因敲除效应，实现在F0代获得与纯合F2代变异体相似的临床表型。根据相关研究报道，这项新的CRISPR/Cas9基因打靶技术，基因敲除效率可达90%以上，产生几乎完全外显的表型，且毒性作用不明显（胚胎畸形率<17%)[1]。不同基因的g RNA往往由于染色体结构不同、未注释的SNP、改变的起始位点或剪切位点等因素产生不同的靶向效率。有时，即便能够靶向到特定的基因，非同源修复也会导致出现部分功能的等位基因而影响敲除效率[13]。与传统的设计一条sg RNA进行打靶相比，这种方法使F0的敲除表型（null phenotype）接近纯合F2代。此项技术可以在短期内获得与F2纯合表型接近的变异体，在对未知功能基因进行筛选中有及其广泛的应用前景。本项研究就是利用该技术，对VASA转基因斑马鱼进行了LHX9的基因敲除，以探究LHX9基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。哺乳动物的性腺发育开始于早期具有双向分化潜能的性腺原基，在睾丸决定因子SRY基因的调控下，性腺原基发育成睾丸，分泌雄激素与抗缪勒试管激素，促使胚胎的雄性化发育，相反的，缺乏SRY基因的个体，胚胎发育则会向雌性化方向进行[14,15]。这个过程中参与的基因目前已知的主要有SRY,SF1,SOX9[16]等。而LHX9作为LIM同源家族的转录因子，目前所广为人知的功能主要是参与了神经系统的发育，其在性腺发育过程中的研究并没有被深入。有趣的是，2000年，birk[2]等在小鼠胚胎发育早期的泌尿生殖嵴中发现了LHX9基因的广泛分布，而原始生殖细胞正是在泌尿生殖嵴处形成。进一步观察发现，LHX9可调控类固醇生成因子（SF-1）的表达；在敲除LHX9的小鼠体内，性腺体细胞出现增殖障碍，雄性小鼠出现外生殖器的雌性化改变，提示该基因在性腺发育中起重要作用。
哺乳动物的性腺发育开始于早期具有双向分化潜能的性腺原基，在睾丸决定因子SRY基因的调控下，性腺原基发育成睾丸，分泌雄激素与抗缪勒试管激素，促使胚胎的雄性化发育，相反的，缺乏SRY基因的个体，胚胎发育则会向雌性化方向进行[14,15]。这个过程中参与的基因目前已知的主要有SRY,SF1,SOX9[16]等。而LHX9作为LIM同源家族的转录因子，目前所广为人知的功能主要是参与了神经系统的发育，其在性腺发育过程中的研究并没有被深入。有趣的是，2000年，birk[2]等在小鼠胚胎发育早期的泌尿生殖嵴中发现了LHX9基因的广泛分布，而原始生殖细胞正是在泌尿生殖嵴处形成。进一步观察发现，LHX9可调控类固醇生成因子（SF-1）的表达；在敲除LHX9的小鼠体内，性腺体细胞出现增殖障碍，雄性小鼠出现外生殖器的雌性化改变，提示该基因在性腺发育中起重要作用。图4 胚胎发育6d的VASA转基因斑马鱼荧光成像。
本文编号：3069551
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3069551.html
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