基于光谱分离的定量荧光共振能量转移检测
发布时间：2021-03-26 06:12
由于天然克服光谱串扰的能力以及高灵敏和无损伤的特性,基于光谱分离的荧光共振能量转移（FRET）定量检测（spFRET）方法被公认为是最有应用潜力的活细胞定量FRET检测技术。首先简要介绍FRET定量检测方法以及国内外的相关研究进展;其次重点介绍基于发射光谱线性分离（Em-unmixing）和基于激发发射光谱线性分离（ExEm-unmixing）的两种定量FRET检测技术的原理、发展进程,并比较了这两种检测技术的稳健性;最后对这两种spFRET技术在活细胞FRET应用中的潜在优势进行展望。
【文章来源】：中国激光. 2020,47(02)北大核心EICSCD
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
CTV、C5V、CVC、VCV、C+V和C32V+C的活HepG2细胞的发射光谱和激发发射光谱[62]。(a)不同FRET结构的细胞荧光图像。比例尺为10 μm;(b)细胞1与细胞2在Ex405和Ex436激发下的单位面积归一化的发射光谱图; (c)细胞1与细胞2在Ex436和Ex470激发下的单位体积归一化的激发发射光谱图
图2为从不同SNR的细胞中测得的E与RC的统计结果[62],原始数据如表1[62]所示。对于RSN>9的细胞,两种方法得到的E与RC值是一致的;对于3<RSN<9的细胞,两种方法都能得到一致的E值,但是用IIem-spFRET方法得到的C5V的RC值是不稳定的,而且VCV的RC值是不准确的;对于RSN<3的细胞,用IIem-spFRET方法得到的C5V和CVC的RC值都不稳定,而且VCV的E和RC值都与文献值和期望值存在偏差。这些结果进一步证明ExEm-spFRET方法的稳健性优于IIem-spFRET方法,尤其当RSN<3时。虽然很高的FPs表达水平有利于提高SNR,但是随机碰撞有可能导致高估E值。例如,在共表达未连接C和V的细胞1中,自由的供体和受体有很高的表达水平,此时E值仍然不为零(约为0.07),这很可能是因为供体分子和受体分子在细胞内是随机碰撞的,因此,进行定量FRET测量时不应选择那些特别亮的细胞。ExEm-spFRET方法测得的VCV的RC值略高于期望值(表1),可能是因为模型质粒VCV的E值比较大(>0.66),460～500 nm波段内激发发射光谱信号非常微弱(供体荧光淬灭),所以两种方法测得的VCV的RC值都存在偏差。表1 ExEm-spFRET方法和IIem-spFRET方法测得的细胞1和2的统计E值和RC值[62]Table 1 Statistical E and RC values in cell 1 and cell 2 measured by ExEm-spFRETand IIem-spFRET method[62] Construct Condition E RC ExEm-spFRET IIem-spFRET ExEm-spFRET IIem-spFRET RSN>9 0.04±0.01 0.04±0.01 0.94±0.03 0.95±0.03 CTV 9>RSN>3 0.04±0.01 0.04±0.01 0.92±0.03 0.94±0.05 RSN<3 0.02±0.01 0.02±0.01 0.91±0.04 0.98±0.12 RSN>9 0.47±0.02 0.47±0.02 1.00±0.03 1.05±0.05 C5V 9>RSN>3 0.45±0.01 0.45±0.01 0.98±0.03 1.04±0.14 RSN<3 0.42±0.02 0.41±0.02 0.95±0.07 0.98±0.20 RSN>9 0.41±0.02 0.42±0.02 0.52±0.01 0.44±0.05 CVC 9>RSN>3 0.40±0.01 0.40±0.01 0.53±0.01 0.46±0.06 RSN<3 0.41±0.02 0.40±0.02 0.49±0.01 0.46±0.29 RSN>9 0.69±0.02 0.69±0.03 2.27±0.16 2.25±0.24 VCV 9>RSN>3 0.67±0.02 0.66±0.02 2.28±0.08 3.12±0.50 RSN<3 0.70±0.02 0.64±0.03 2.31±0.02 4.28±1.37 RSN>9 0.04±0.01 0.03±0.01 0.73±0.22 0.76±0.23 C+V 9>RSN>3 0.04±0.02 0.03±0.02 0.81±0.22 0.85±0.23 RSN<3 0.04±0.01 0.01±0.01 0.83±0.48 0.83±0.52 RSN>9 0.23±0.05 0.23±0.05 0.67±0.13 0.76±0.18 C32V+C 9>RSN>3 0.23±0.04 0.23±0.05 0.70±0.13 0.68±0.21 RSN<3 0.22±0.06 0.22±0.06 0.66±0.19 0.63±0.23
本文编号：3101106
【文章来源】：中国激光. 2020,47(02)北大核心EICSCD
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
CTV、C5V、CVC、VCV、C+V和C32V+C的活HepG2细胞的发射光谱和激发发射光谱[62]。(a)不同FRET结构的细胞荧光图像。比例尺为10 μm;(b)细胞1与细胞2在Ex405和Ex436激发下的单位面积归一化的发射光谱图; (c)细胞1与细胞2在Ex436和Ex470激发下的单位体积归一化的激发发射光谱图
图2为从不同SNR的细胞中测得的E与RC的统计结果[62],原始数据如表1[62]所示。对于RSN>9的细胞,两种方法得到的E与RC值是一致的;对于3<RSN<9的细胞,两种方法都能得到一致的E值,但是用IIem-spFRET方法得到的C5V的RC值是不稳定的,而且VCV的RC值是不准确的;对于RSN<3的细胞,用IIem-spFRET方法得到的C5V和CVC的RC值都不稳定,而且VCV的E和RC值都与文献值和期望值存在偏差。这些结果进一步证明ExEm-spFRET方法的稳健性优于IIem-spFRET方法,尤其当RSN<3时。虽然很高的FPs表达水平有利于提高SNR,但是随机碰撞有可能导致高估E值。例如,在共表达未连接C和V的细胞1中,自由的供体和受体有很高的表达水平,此时E值仍然不为零(约为0.07),这很可能是因为供体分子和受体分子在细胞内是随机碰撞的,因此,进行定量FRET测量时不应选择那些特别亮的细胞。ExEm-spFRET方法测得的VCV的RC值略高于期望值(表1),可能是因为模型质粒VCV的E值比较大(>0.66),460～500 nm波段内激发发射光谱信号非常微弱(供体荧光淬灭),所以两种方法测得的VCV的RC值都存在偏差。表1 ExEm-spFRET方法和IIem-spFRET方法测得的细胞1和2的统计E值和RC值[62]Table 1 Statistical E and RC values in cell 1 and cell 2 measured by ExEm-spFRETand IIem-spFRET method[62] Construct Condition E RC ExEm-spFRET IIem-spFRET ExEm-spFRET IIem-spFRET RSN>9 0.04±0.01 0.04±0.01 0.94±0.03 0.95±0.03 CTV 9>RSN>3 0.04±0.01 0.04±0.01 0.92±0.03 0.94±0.05 RSN<3 0.02±0.01 0.02±0.01 0.91±0.04 0.98±0.12 RSN>9 0.47±0.02 0.47±0.02 1.00±0.03 1.05±0.05 C5V 9>RSN>3 0.45±0.01 0.45±0.01 0.98±0.03 1.04±0.14 RSN<3 0.42±0.02 0.41±0.02 0.95±0.07 0.98±0.20 RSN>9 0.41±0.02 0.42±0.02 0.52±0.01 0.44±0.05 CVC 9>RSN>3 0.40±0.01 0.40±0.01 0.53±0.01 0.46±0.06 RSN<3 0.41±0.02 0.40±0.02 0.49±0.01 0.46±0.29 RSN>9 0.69±0.02 0.69±0.03 2.27±0.16 2.25±0.24 VCV 9>RSN>3 0.67±0.02 0.66±0.02 2.28±0.08 3.12±0.50 RSN<3 0.70±0.02 0.64±0.03 2.31±0.02 4.28±1.37 RSN>9 0.04±0.01 0.03±0.01 0.73±0.22 0.76±0.23 C+V 9>RSN>3 0.04±0.02 0.03±0.02 0.81±0.22 0.85±0.23 RSN<3 0.04±0.01 0.01±0.01 0.83±0.48 0.83±0.52 RSN>9 0.23±0.05 0.23±0.05 0.67±0.13 0.76±0.18 C32V+C 9>RSN>3 0.23±0.04 0.23±0.05 0.70±0.13 0.68±0.21 RSN<3 0.22±0.06 0.22±0.06 0.66±0.19 0.63±0.23
本文编号：3101106
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