基于CRISPR/dCas的转录激活系统在水稻中的应用
发布时间：2021-04-29 09:40
CRISPR/Cas系统的发现,推动了生物学诸多研究领域的快速发展,近年来在此系统的基础上又衍生出了CRISPR/d Cas系统,该系统在基因表达水平调控方面发挥着巨大的作用。目前几种基于CRISPR/d Cas9的高效转录激活系统已被开发用于动物和人体细胞,然而d Cas9介导的转录激活在植物中的研究却相对较少且主要集中于双子叶植物拟南芥中;而且大量的工作着重于鉴定和优化d Cas9与激活结构域的融合,对于植物中启动子区域向导RNA（guide RNA,g RNA）靶位点对转录激活效率的影响知之甚少。另外,CRISPR/Cpf1系统作为新型的CRISPR/Cas系统,它的出现使得基因编辑靶位点的选择更为丰富,由于脱靶效应极低以及cr RNA结构的特异性,CRISPR/d Cpf1系统在多重基因调控方面更具优势,但是应用难度较大,很多研究也处于探索阶段。本课题从CRISPR/d Cas9入手,开展水稻中的转录激活研究。首先我们构建了第二代的d Cas9-SAM系统,并对其在水稻中的转录激活效果进行了分析,发现其激活效率不理想。因此我们又选择了在植物原生质体中被证明转录激活效率较高的d ...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1.前言
1.1 研究问题的由来
1.2 文献综述
1.2.1 CRISPR/Cas9 系统的概述
1.2.2 CRISPR/d Cas9 系统的研究进展
1.2.3 基于CRISPR/d Cas9 转录激活系统的研究进展
1.2.3.1 转录调节因子的研究进展
1.2.3.2 不同转录激活系统的应用
1.2.4 CRISPR/Cpf1 系统的概述
1.2.5 CRISPR/d Cas9 转录激活系统中g RNA设计问题
1.2.6 转录激活报告基因
1.2.6.1 OsWOX11基因功能概述
1.2.6.2 OsYUC1基因功能概述
1.3 研究的目的和意义
2.材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及质粒
2.1.3 基因的序列信息及登录号
2.2 实验方法
2.2.1 转录激活载体的构建
2.2.2 阳性克隆的筛选
2.2.3 遗传转化
2.2.4 水稻总DNA抽提
2.2.5 RNA抽提、反转录以及q RT-PCR
3.结果与分析
3.1 d Cas9-SAM转录激活系统在水稻中的探索
3.1.1 d Cas9-SAM系统的构建与验证
3.1.2 d Cas9-SAM转化植株的阳性鉴定及表型考察
3.1.3 d Cas9-SAM转化植株的表达量检测
3.2 d Cas9-TV转录激活系统在水稻中的探索
3.2.1 d Cas9-TV系统的优化与验证
3.2.2 d Cas9-TV转化植株的阳性鉴定及表型考察
3.2.3 d Cas9-TV转化植株的表达量检测
3.3 最佳gRNA靶向区域的探索
3.4 dCpf1介导的转录激活系统在水稻中的初步探索
4.讨论
4.1 dCas9介导的转录激活系统适应性及效率分析
4.2 转录激活系统的策略分析
4.3 存在问题及未来研究方向
参考文献
附录
附录A 本研究所用到引物信息
附录B 部分实验的详细操作步骤
B1 水稻的遗传转化
B2 TIANGENG DNA试剂盒纯化回收
B3 感受态细胞的制备
附录C 在读期间研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Self-cleaving ribozymes enable the production of guide RNAs from unlimited choices of promoters for CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J]. Yubing He,Tao Zhang,Ning Yang,Meilian Xu,Lang Yan,Lihao Wang,Rongchen Wang,Yunde Zhao. Journal of Genetics and Genomics. 2017(09)
本文编号：3167296
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1.前言
1.1 研究问题的由来
1.2 文献综述
1.2.1 CRISPR/Cas9 系统的概述
1.2.2 CRISPR/d Cas9 系统的研究进展
1.2.3 基于CRISPR/d Cas9 转录激活系统的研究进展
1.2.3.1 转录调节因子的研究进展
1.2.3.2 不同转录激活系统的应用
1.2.4 CRISPR/Cpf1 系统的概述
1.2.5 CRISPR/d Cas9 转录激活系统中g RNA设计问题
1.2.6 转录激活报告基因
1.2.6.1 OsWOX11基因功能概述
1.2.6.2 OsYUC1基因功能概述
1.3 研究的目的和意义
2.材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及质粒
2.1.3 基因的序列信息及登录号
2.2 实验方法
2.2.1 转录激活载体的构建
2.2.2 阳性克隆的筛选
2.2.3 遗传转化
2.2.4 水稻总DNA抽提
2.2.5 RNA抽提、反转录以及q RT-PCR
3.结果与分析
3.1 d Cas9-SAM转录激活系统在水稻中的探索
3.1.1 d Cas9-SAM系统的构建与验证
3.1.2 d Cas9-SAM转化植株的阳性鉴定及表型考察
3.1.3 d Cas9-SAM转化植株的表达量检测
3.2 d Cas9-TV转录激活系统在水稻中的探索
3.2.1 d Cas9-TV系统的优化与验证
3.2.2 d Cas9-TV转化植株的阳性鉴定及表型考察
3.2.3 d Cas9-TV转化植株的表达量检测
3.3 最佳gRNA靶向区域的探索
3.4 dCpf1介导的转录激活系统在水稻中的初步探索
4.讨论
4.1 dCas9介导的转录激活系统适应性及效率分析
4.2 转录激活系统的策略分析
4.3 存在问题及未来研究方向
参考文献
附录
附录A 本研究所用到引物信息
附录B 部分实验的详细操作步骤
B1 水稻的遗传转化
B2 TIANGENG DNA试剂盒纯化回收
B3 感受态细胞的制备
附录C 在读期间研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Self-cleaving ribozymes enable the production of guide RNAs from unlimited choices of promoters for CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J]. Yubing He,Tao Zhang,Ning Yang,Meilian Xu,Lang Yan,Lihao Wang,Rongchen Wang,Yunde Zhao. Journal of Genetics and Genomics. 2017(09)
本文编号：3167296
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3167296.html
