RBM47磷酸化在心脏再生中的分子机制
发布时间：2021-05-31 22:33
心脏再生是一个复杂而精密的过程,涉及细胞的增殖、分化与组织形态的重建,RNA结合蛋白（RBP）在这一过程中发挥关键的作用。RBM47是一种RNA结合蛋白,具有调控mRNA可变剪接、碱基编辑和多聚腺苷化的作用,在早期神经发育和肿瘤发展中有显著功能。我们发现RBM47在新生小鼠和成年斑马鱼的心脏损伤中表达上调,且存在二聚体与剪切体的形式。推测RBM47二聚化和剪切体形成与蛋白翻译后修饰有关,我们应用亲和质谱技术鉴定了RBM47的磷酸化位点。其中位于RBM47RNA结合域中的S309位点磷酸化受心脏损伤激活,T314位点磷酸化水平在心脏损伤中被抑制。推测RBM47S309位点磷酸化参与心脏再生过程。我们发现RBM47S309位点的上游磷酸激酶是GRK2,GRK2可能介导RBM47对外界压力的响应,其中RBM47S309与T314位点磷酸化均能被低氧激活（1%O2）,精神压力可能抑制RBM47S309与T314位点磷酸化。综上所述,我们的研究以RBM47磷酸化为切入点,讨论了RBM47磷酸化与二聚体、剪切体之间的关系,探究蛋白激酶调节下RBM47磷酸化在心脏再生中的作用。
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GRK2在一般条件下存在与细胞质中，在GPCR活化时，GRK2通过与定位在膜上的Gbc结合而易位至细胞膜膜
图 3 RBM47 二聚体与剪切体的分布Fig. 3 Distribution of RBM47 dimer and splicingRBM47 二聚体与剪切体的分布情况。RBM47 在细胞中存在三种表达构型，可以被 western 的构型分别处在 130 KD、72 KD 和 34 KD 的位置，我们推测 RBM47 潜在的翻译后修饰与之理能够抑制 RBM47 在 130 KD、72 KD 和 34 KD 处的表达分布。分别将靶向 RBM47 的 siRNA 时转染到 HCT116 细胞中， 72 小时后，提取蛋白用以 Western Blot 实验，用 RBM47 和 AD、72 KD 和 34 KD 处为特异条带，二聚体（130 KDa）与剪切体（34 KDa）均能被 siRNA淀实验验证 RBM47 在细胞中的三种存在形式。将生长旺盛的 HCT116 细胞用细胞裂解液裂抗体进行免疫共沉淀反应。将免疫共沉淀反应复合体进行 western blot，用 RBM47 抗体检与剪切体三种形式都存在。C）外源表达的 RBM47 蛋白在细胞内除 72 KD 条带外，34 KDa 检测到。将带有 Flag 标签的 RBM47 蛋白超量表达于 HCT116 细胞中，24 小时后收集细胞裂lot，用 Flag 抗体，RBM47 抗体和 Actin 抗体检测。（与其他同学合作）。3 Distribution of RBM47 dimer and splicing. There are three configurations of RBM47 in cells, wd by western bolt as specific signal at 130KD, 72KD and 34KD. We speculate that thlational modification of RBM47 is related to it. A) SiRNA treatment can inhibit three configoth siRNA targeting the RBM47 and Scramble siRNA were transiently transfected into HCT116
图 4 RBM47 二聚体与剪切体的动态变化Fig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. 4 RBM47 二聚体与剪切体的动态变化。A）DTT 处理后，斑马鱼样品 95 KDa 以上的条带消失，小鼠样 KDa 处条带信号减弱。将组织样品取出 30 μL 加入 0.3 μL DTT（终浓度保持在 10mM），室温处理 30 min；入 7.5 μLIODO（终浓度维持在 100mM），避光室温处理 1 h。将处理后的样品以 RBM47 抗体进行 westeB）斑马鱼 95 KDa 处条带信号重新出现，小鼠样品的 55 KDa 处信号增强，而 95KDa 处信号消失。2 天DTT 样品再次检测。C）细胞样品没有显著变化。用 DTT 对细胞样品处理，以 RBM47 抗体进行 westeD）半胱氨酸全突变后，RBM47 在 130 KDa 处信号消失，34 KDa 处信号减弱。构建了 RBM47-CtoA 的达载体，将半胱氨酸全部突变为丙氨酸，并与 RBM47-WT 超量表达载体一同转染 HCT116 细胞。ig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. A) After DTT treatment, the band above 95 KDa of thish samples was disappeared, and the signal at 95 KDa of the mouse samples was attenuated. Tissue samples（3were added to 0.3 μL TT (final concentration 10 mM), treated at room temperature for 30 min; then added 7.5 μ (final concentration 100 mM) was, and treated at room temperature for 1 h （Protected from light）. The DT samples were subjected to western blot analysis with antibody against RBM47. B) The signal at the 95KDa ish reappeared, the signal at 55KDa in the mouse sample was enhanced, and the signal at 95KDa disappeare
本文编号：3209098
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GRK2在一般条件下存在与细胞质中，在GPCR活化时，GRK2通过与定位在膜上的Gbc结合而易位至细胞膜膜
图 3 RBM47 二聚体与剪切体的分布Fig. 3 Distribution of RBM47 dimer and splicingRBM47 二聚体与剪切体的分布情况。RBM47 在细胞中存在三种表达构型，可以被 western 的构型分别处在 130 KD、72 KD 和 34 KD 的位置，我们推测 RBM47 潜在的翻译后修饰与之理能够抑制 RBM47 在 130 KD、72 KD 和 34 KD 处的表达分布。分别将靶向 RBM47 的 siRNA 时转染到 HCT116 细胞中， 72 小时后，提取蛋白用以 Western Blot 实验，用 RBM47 和 AD、72 KD 和 34 KD 处为特异条带，二聚体（130 KDa）与剪切体（34 KDa）均能被 siRNA淀实验验证 RBM47 在细胞中的三种存在形式。将生长旺盛的 HCT116 细胞用细胞裂解液裂抗体进行免疫共沉淀反应。将免疫共沉淀反应复合体进行 western blot，用 RBM47 抗体检与剪切体三种形式都存在。C）外源表达的 RBM47 蛋白在细胞内除 72 KD 条带外，34 KDa 检测到。将带有 Flag 标签的 RBM47 蛋白超量表达于 HCT116 细胞中，24 小时后收集细胞裂lot，用 Flag 抗体，RBM47 抗体和 Actin 抗体检测。（与其他同学合作）。3 Distribution of RBM47 dimer and splicing. There are three configurations of RBM47 in cells, wd by western bolt as specific signal at 130KD, 72KD and 34KD. We speculate that thlational modification of RBM47 is related to it. A) SiRNA treatment can inhibit three configoth siRNA targeting the RBM47 and Scramble siRNA were transiently transfected into HCT116
图 4 RBM47 二聚体与剪切体的动态变化Fig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. 4 RBM47 二聚体与剪切体的动态变化。A）DTT 处理后，斑马鱼样品 95 KDa 以上的条带消失，小鼠样 KDa 处条带信号减弱。将组织样品取出 30 μL 加入 0.3 μL DTT（终浓度保持在 10mM），室温处理 30 min；入 7.5 μLIODO（终浓度维持在 100mM），避光室温处理 1 h。将处理后的样品以 RBM47 抗体进行 westeB）斑马鱼 95 KDa 处条带信号重新出现，小鼠样品的 55 KDa 处信号增强，而 95KDa 处信号消失。2 天DTT 样品再次检测。C）细胞样品没有显著变化。用 DTT 对细胞样品处理，以 RBM47 抗体进行 westeD）半胱氨酸全突变后，RBM47 在 130 KDa 处信号消失，34 KDa 处信号减弱。构建了 RBM47-CtoA 的达载体，将半胱氨酸全部突变为丙氨酸，并与 RBM47-WT 超量表达载体一同转染 HCT116 细胞。ig. 4 Dynamic changes in RBM47 dimer and splicing. A) After DTT treatment, the band above 95 KDa of thish samples was disappeared, and the signal at 95 KDa of the mouse samples was attenuated. Tissue samples（3were added to 0.3 μL TT (final concentration 10 mM), treated at room temperature for 30 min; then added 7.5 μ (final concentration 100 mM) was, and treated at room temperature for 1 h （Protected from light）. The DT samples were subjected to western blot analysis with antibody against RBM47. B) The signal at the 95KDa ish reappeared, the signal at 55KDa in the mouse sample was enhanced, and the signal at 95KDa disappeare
本文编号：3209098
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