拟南芥in situ Hi-C实验开发及应用
发布时间：2021-06-05 22:44
三维基因组学（Three-Dimensional Genomics,3D Genomics）是一门研究染色质的空间结构与功能的新兴学科,对于解析基因组折叠机制、基因功能、非编码DNA元件或基因挖掘等起到重要作用。In situ Hi-C是改良的高通量染色质捕获技术（High-throughput chromosome conformation capture,Hi-C）,通过保证实验前期细胞核的完整性,相比较传统Hi-C而言能有效减少实验背景噪声,提高交互矩阵分辨率。Insitu Hi-C最初是针对人类、小鼠等动物细胞研究开发的技术,但由于植物细胞存在细胞壁从而难以获得完整的细胞核,使其应用受到限制。本研究不仅通过温和的方式去掉细胞壁,将in situ Hi-C应用于模式植物拟南芥中,并针对实验过程的酶切条件、建库、细胞数量等关键步骤进行改进,优化了原始的Hi-C实验流程。首先,传统Hi-C技术使用6位酶切位点限制性内切酶（6-位酶）进行酶切,酶切位点少,本实验改用4-位酶能有效增加片段丰富度。其次,在传统建库中先捕获300-500 bp片段再进行建库,有效交互少,本研究改进建库流程,...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２?３Ｃ及其衍生技术原理图（ＲｉｓｃａａｎｄＧｒｅｅｎｌｅａｆ２０］５）??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ?ｃｏｎｆｏ?
图２．１拟南芥突变体与野生型幼苗形态??Ｆｉｇ．?２．１?Ｔｈｅ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｍｕｔａｎｔ?ａｎｄ?ｗｉｌｄ?ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ?ｏｆ?Ａｒｃｉｂｉｄｏｐｓｉｓ?ｔｈａｌｉａｎａ??试剂耗材??生质体获取：ＣｅｌｌｕｌａｓｅＲ－１０?纤维素酶，ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ－１０?离析酶，Ｄ－Ｍｉｏｓｈａｒｐ，ＭＥＳ、ＢＳＡ购自Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，其余试剂为国产分析纯试剂??ｉ－Ｃ?实验：Ｍｂｏｌ、Ｔ４ＤＮＡ?聚合酶、Ｋｌｅｎｏｗ?大片段、Ｔ４ＰＮＫ、Ｔ４ＤＮＡ液?ｌ〇ｘＮＥＢ?ｂｕｆｆｅｒ２、ｌ〇ｘＤＮＡ?ｌｉｇａｓｅ?ｂｕｆｆｅｒ?购自?Ｎｅｗ?Ｅｎｇｌａｎｄ?Ｂｉｏｌａｂ（Ｎ醛、Ｔｒｉｔｏｎ?Ｘ－１００、ＰＥＧ?４０００、ＮａＡｃ?溶液、ｐｒｏｔｅａｓｅ?ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?ｃｏｃｋｔａｉｌ?购自?ｈ?公司。２０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ?购自大连宝生物（ＴａＫａＲａ）公司。ＲＮＡａｓｅ、ｄＮＴＰｓ购自?Ｔｈｅｒｍｏ?公司。ｂｉｏｔｉｎ－１４－ｄＣＴＰ、ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙＯｎｅＳｔｒｅｐｔａｖｉｎ?Ｃｌ?Ｂｅｉｔｒｏｇｅｎ?公司。建库试剂盒购自?Ｉｌｌｕｍｉｎａ?公司的?ＴｒｕＳｅｑ?ＤＮＡ?Ｓａｍｐｌｅ?Ｐｒｅｐｍｐｕｒｅ?ＸＰ?ｂｅａｄｓ?购自?Ｂｅｃｋｍａｎ?公司。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ?低吸附离心管购自?Ｅｐｐ
?８３．１７ｍｌ??将细胞悬浮液过４０?ｐｍ细胞筛，４°Ｃ，１００?ｒ／ｍｉｎ离心５?ｍｉｎ，收集原生质体，??用１?ｍｌ?Ｗ５缓冲液混匀，在光学显微镜Ｆ观察细胞状态，原生质体如图２．２所示。??■??■?？?ｔ、??图２．２拟南芥叶片原生质体的形态??左侧蓝色箭头指向的原生质体较为饱满，为实验较为理想的材料；右侧红色箭头指向的为细胞碎片，若细胞碎??片较多，会对后续实验造成一定影响??Ｆｉｇ．?２．２?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ?ｉｎ?Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ?Ｌｅａｖｅｓ??Ｔｈｅ?ｂｌｕｅ?ａｒｒｏｗ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｌｅｆｔ?ｐｏｉｎｔｅｄ?ｔｏ?ｉｓ?ｆｕｌｌｅｒ?ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ，?ｗｈｉｃｈ?ｉｓ?ａｎ?ｉｄｅａｌ?ｍａｔｅｒｉａｌ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；?Ｔｈｅ?ｒｅｄ?ａｒｒｏｗ?ｏｎ??ｔｈｅ?ｒｉｇｈｔ?ｐｏｉｎｔｓ?ｔｏ?ｉｓ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｄｅｂｒｉｓ．?Ｉｆ?ｔｈｅｒｅ?ａｒｅ?ｍｏｒｅ?ｃｅｌｌ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，?ｉｔ?ｗｉｌｌ?ａｆｆｅｃｔ?ｔｈｅ?ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．??使用血细胞计数板进行计数，若细胞较为纯净，则进行后续实验，若原生质体??杂质较多，则将样品置于冰上静置ｌ〇ｍｉｎ左右，我们可以看到溶液分层，下层为质??量较大的原生质体，上层为质量较轻的细胞碎片，吸取上层溶液弃置，用Ｗ５缓冲??液稀释至ｌｍｌ
【参考文献】：
期刊论文
[1]三维基因组学与精准生物学[J]. 张玉波. 中国生物化学与分子生物学报. 2018(04)
[2]起航三维基因组学研究[J]. 李国亮,阮一骏,谷瑞升,杜生明. 科学通报. 2014(13)
本文编号：3213061
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２?３Ｃ及其衍生技术原理图（ＲｉｓｃａａｎｄＧｒｅｅｎｌｅａｆ２０］５）??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ?ｃｏｎｆｏ?
图２．１拟南芥突变体与野生型幼苗形态??Ｆｉｇ．?２．１?Ｔｈｅ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｍｕｔａｎｔ?ａｎｄ?ｗｉｌｄ?ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ?ｏｆ?Ａｒｃｉｂｉｄｏｐｓｉｓ?ｔｈａｌｉａｎａ??试剂耗材??生质体获取：ＣｅｌｌｕｌａｓｅＲ－１０?纤维素酶，ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ－１０?离析酶，Ｄ－Ｍｉｏｓｈａｒｐ，ＭＥＳ、ＢＳＡ购自Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，其余试剂为国产分析纯试剂??ｉ－Ｃ?实验：Ｍｂｏｌ、Ｔ４ＤＮＡ?聚合酶、Ｋｌｅｎｏｗ?大片段、Ｔ４ＰＮＫ、Ｔ４ＤＮＡ液?ｌ〇ｘＮＥＢ?ｂｕｆｆｅｒ２、ｌ〇ｘＤＮＡ?ｌｉｇａｓｅ?ｂｕｆｆｅｒ?购自?Ｎｅｗ?Ｅｎｇｌａｎｄ?Ｂｉｏｌａｂ（Ｎ醛、Ｔｒｉｔｏｎ?Ｘ－１００、ＰＥＧ?４０００、ＮａＡｃ?溶液、ｐｒｏｔｅａｓｅ?ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?ｃｏｃｋｔａｉｌ?购自?ｈ?公司。２０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ?购自大连宝生物（ＴａＫａＲａ）公司。ＲＮＡａｓｅ、ｄＮＴＰｓ购自?Ｔｈｅｒｍｏ?公司。ｂｉｏｔｉｎ－１４－ｄＣＴＰ、ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙＯｎｅＳｔｒｅｐｔａｖｉｎ?Ｃｌ?Ｂｅｉｔｒｏｇｅｎ?公司。建库试剂盒购自?Ｉｌｌｕｍｉｎａ?公司的?ＴｒｕＳｅｑ?ＤＮＡ?Ｓａｍｐｌｅ?Ｐｒｅｐｍｐｕｒｅ?ＸＰ?ｂｅａｄｓ?购自?Ｂｅｃｋｍａｎ?公司。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ?低吸附离心管购自?Ｅｐｐ
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【参考文献】：
期刊论文
[1]三维基因组学与精准生物学[J]. 张玉波. 中国生物化学与分子生物学报. 2018(04)
[2]起航三维基因组学研究[J]. 李国亮,阮一骏,谷瑞升,杜生明. 科学通报. 2014(13)
本文编号：3213061
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