基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

发布时间：2021-06-11 03:43

　　建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T₀种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T₁植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T₁不含荧光的种子进行培育得到的T₂植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Fre... 

【文章来源】：华北农学报. 2020,35(01)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

pHDE-mCherry-ALB3表达载体的构建

序列比对结果

重组质粒转化农杆菌GV3103感受态细胞后,为了验证是否成功转化,对其菌液进行PCR鉴定,鉴定结果(图3)显示条带大小在500～750 bp,符合预期大小,说明工程菌转化成功。2.3 转化后代的可视化筛选

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3223740