三种肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质研究
发布时间：2021-06-16 01:23
肝素酶Ⅰ（Hep Ⅰ）是一种可以特异性将肝素降解为低聚糖或不饱和二糖的多糖裂解酶,可用于低分子量肝素的制备,体外循环中肝素的消除以及肝素精确结构的确定。本文选择了三种不同来源的肝素酶I,构建可溶性表达肝素酶I的大肠杆菌表达系统,制备了三种重组肝素酶I,对其表达过程和酶学性质进行研究,并对肝素酶I与底物肝素的作用方式进行了初步探索,主要研究内容包括:1)选择来源于Bacteroides eggerthii VPI T5-42B-1、Bacteroides xylanisolvens SDCC 2a和Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的三种肝素酶I,分别命名为BeHep Ⅰ、BxHep Ⅰ和BcHep Ⅰ,各自编码394、381和389个氨基酸残基。成功构建了三种pET-28a-Hep Ⅰ表达载体,通过E.coli BL21（DE3）表达可溶性肝素酶I。2)对三种重组肝素酶Ⅰ进行表达研究。诱导BeHep Ⅰ的最适IPTG浓度为0.1mM,温度为30℃,诱导时长为6 h,得到的粗酶活力为5038 U·L-1。经镍柱亲和纯化后,得...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
肝素酶I-III对肝素和硫酸乙酰肝素的裂解Fig.1.1DegradationofheparinandheparinsulfatebyheparinasesI-III
三种肝素酶I的克隆表达及性质研究202.2结果与讨论2.2.1B.eggerthiiVPIT5-42B-1肝素酶I序列分析图2.2BeHepI与其他三种肝素酶I序列比对Fig.2.2.MultiplesequencealignmentofheparinasesfromB.eggerthii(BeHepI),F.heparinum(FhHepI),B.thetaiotaomicron(BtHepI)andB.stercoris(BsHepI)从PIR（https://proteininformationresource.org）数据库中下载来源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的HepI基因序列，利用Clustal-W[68]在线服务器对BeHepI的氨基酸序列与其他同源物进行比较，对肝素酶I的关键氨基酸进行分析，并使用ESPript进行作图[69]。来源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的肝素酶I基因长度为1182bp，编码394个氨基酸，其中1~22个氨基酸属于信号肽序列。BeHepI的理论分子量为44.56kDa，等电点为9.55，切除信号肽后的蛋白理论分子量为42.23kDa。图2.2结果显示BeHepI的蛋白序列与FhHepI、BtHepI和BsHepI的蛋白序列一致性分别为62.4%、81.5%和89.3%。FhHepI的三个关键氨基酸Cys135、His203和Lys199（分别用▲、和标注）在BeHepI中是高度保守的。Cys135是FhHepI在裂
江苏大学硕士学位论文21解肝素过程中重要的亲核氨基酸[31]。His203是激活FhHepI通过β-消除反应催化底物肝素的关键氨基酸残基，Lys199是FhHepI中两个钙离子结合位点之一，对于维持肝素酶I的催化活性有重要意义[70]。推测这三个氨基酸残基在BeHepI的催化过程中同样发挥重要的作用。2.2.2重组HepI表达载体的构建为了验证HepI基因是否与pET-28a载体连接成功，使用BamHI和HindIII两种限制性内切酶对连接得到的载体进行处理，如图2.3琼脂糖凝胶电泳结果显示，出现了两个所在位置与理论值相符的条带，分别对应于pET-28a质粒（5369bp）和HepI目的基因片段（1128bp），验证了pET-28a-HepI表达载体连接成功。为了确保重组质粒没有出现单点或多点突变，对质粒载体进行基因测序，测序结果与GenBank中BeHepI序列一致，说明pET-28a-HepI表达载体构建成功。图2.3pET-28a-HepI表达载体双酶切实验（M：DNAladder；1：双酶切产物）Fig.2.3DoubledigestionreactionofpET-28a-HepI(M:DNAladder,1:productionofthedoubledigestionreaction)2.2.3重组HepI表达条件的优化2.2.3.1IPTG浓度对HepI活力的影响IPTG不会被菌体代谢因而作为乳糖的替代品用于外源蛋白的表达，IPTG在诱导目的蛋白表达时受其浓度的影响，而且会对菌体产生抑制作用[71]。因而使用适宜浓度的IPTG对HepI进行诱导至关重要。图2.4.1为IPTG浓度对HepI粗
本文编号：3232083
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
肝素酶I-III对肝素和硫酸乙酰肝素的裂解Fig.1.1DegradationofheparinandheparinsulfatebyheparinasesI-III
三种肝素酶I的克隆表达及性质研究202.2结果与讨论2.2.1B.eggerthiiVPIT5-42B-1肝素酶I序列分析图2.2BeHepI与其他三种肝素酶I序列比对Fig.2.2.MultiplesequencealignmentofheparinasesfromB.eggerthii(BeHepI),F.heparinum(FhHepI),B.thetaiotaomicron(BtHepI)andB.stercoris(BsHepI)从PIR（https://proteininformationresource.org）数据库中下载来源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的HepI基因序列，利用Clustal-W[68]在线服务器对BeHepI的氨基酸序列与其他同源物进行比较，对肝素酶I的关键氨基酸进行分析，并使用ESPript进行作图[69]。来源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的肝素酶I基因长度为1182bp，编码394个氨基酸，其中1~22个氨基酸属于信号肽序列。BeHepI的理论分子量为44.56kDa，等电点为9.55，切除信号肽后的蛋白理论分子量为42.23kDa。图2.2结果显示BeHepI的蛋白序列与FhHepI、BtHepI和BsHepI的蛋白序列一致性分别为62.4%、81.5%和89.3%。FhHepI的三个关键氨基酸Cys135、His203和Lys199（分别用▲、和标注）在BeHepI中是高度保守的。Cys135是FhHepI在裂
江苏大学硕士学位论文21解肝素过程中重要的亲核氨基酸[31]。His203是激活FhHepI通过β-消除反应催化底物肝素的关键氨基酸残基，Lys199是FhHepI中两个钙离子结合位点之一，对于维持肝素酶I的催化活性有重要意义[70]。推测这三个氨基酸残基在BeHepI的催化过程中同样发挥重要的作用。2.2.2重组HepI表达载体的构建为了验证HepI基因是否与pET-28a载体连接成功，使用BamHI和HindIII两种限制性内切酶对连接得到的载体进行处理，如图2.3琼脂糖凝胶电泳结果显示，出现了两个所在位置与理论值相符的条带，分别对应于pET-28a质粒（5369bp）和HepI目的基因片段（1128bp），验证了pET-28a-HepI表达载体连接成功。为了确保重组质粒没有出现单点或多点突变，对质粒载体进行基因测序，测序结果与GenBank中BeHepI序列一致，说明pET-28a-HepI表达载体构建成功。图2.3pET-28a-HepI表达载体双酶切实验（M：DNAladder；1：双酶切产物）Fig.2.3DoubledigestionreactionofpET-28a-HepI(M:DNAladder,1:productionofthedoubledigestionreaction)2.2.3重组HepI表达条件的优化2.2.3.1IPTG浓度对HepI活力的影响IPTG不会被菌体代谢因而作为乳糖的替代品用于外源蛋白的表达，IPTG在诱导目的蛋白表达时受其浓度的影响，而且会对菌体产生抑制作用[71]。因而使用适宜浓度的IPTG对HepI进行诱导至关重要。图2.4.1为IPTG浓度对HepI粗
本文编号：3232083
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