超分辨显微技术中光激活荧光蛋白性质的测定及大肠杆菌趋化信号与运动行为的关联研究
发布时间：2021-06-22 08:29
为了探寻微观世界的奥秘,显微技术自16世纪发明以来,已经得到了巨大的发展。除了不断提升的分辨率之外,它们的种类和应用领域也越来越广泛。光学显微镜因其非直接接触、损伤小的特性,往往是生物样品观测的优先选择。近年来,各类荧光探针的发展为生物结构成像提供了丰富的选择与方法。其中,光可控的荧光蛋白与染料分子也使远场光学显微技术得以突破光学衍射极限,最为典型的就是光激活定位显微成像技术（photoactivated localization microscopy,PALM）与随机光学重构显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy,STORM）。本文的研究工作基于常见的原核生物——大肠杆菌而进行,同时结合了荧光显微技术与其他实验手段。大肠杆菌具有繁殖快、培养简单、毒性较小等优势,是研究最为广泛的细菌之一。本文的第一章为绪论部分,较为详细地介绍了研究领域的背景与已取得的成果,并总结了研究工作的目标与意义。我们的研究对象主要包括大肠杆菌与光激活荧光蛋白（photoactivatable fluorescent proteins,PA-FPs）,在...
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１荧光发射过程中的Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ能级图
而多管??水母属会发出绿光而不是蓝光的原因也被Ｍｏｒｉｓｅ等人所揭示出来。原来在水母??体内还存在着另一种绿色焚光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），水母素发射??的蓝光在ＧＦＰ?．的吸收谱内，导致这两种蛋白之间发生了荧光共振能量转移??（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ?ｅｎｅｒｇｙ?ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ），从而刺激?ＧＦＰ?发出绿色焚光，??造成了次级荧光光谱的红移［３］。接下来，Ｓｈｉｍｏｍｕｒ又研宄了?ＧＦＰ的发色团结构??Ｗ，如图１．２所示。与水母素所需要的较为复杂的发光条件不同，当ＧＦＰ暴露在??紫外光或蓝光中，它就能发出绿色的荧光。正是由于这种特性，它引起了许多生??物学家的关注。然而，仅仅将ＧＦＰ提纯出来并不能满足科学要求。要想成功利??用ＧＦＰ进行生物结构的标记、示踪等研究，还需在基因层面上进行解析，让ＧＦＰ??能够在生物体内完成自主表达。??纖??Ａｅｑｕｏｒｅａ?ｖｉｃｔｏｒｉａ??ｈｉｇｈ?ｅｎｅｒｇｙ?ｌｏｗ?ｅｎｅｒｇｙ??■?：ａ：ｉ??图１．２发出绿色黄光的维多利亚多管水母。（图片来源：ｗｗｗ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ）??１９９２年，Ｐｒａｓｈｅｒ等人成功地克隆了?ＧＦＰ的ｃＤＮＡ，为荧光蛋白标签应用于??生物学观察提供了基因层面上的依据。同时，他们也分析了?ＧＦＰ的一级结构，??为进一步理解ＧＦＰ的发光特性提供了帮助［５］。１９９４年，Ｃｈａｌｆｉｅ等人首次将荧光??蛋白克隆到大肠杆菌和线虫中并成功表达，并得出了?ＧＦＰ发光并不需要其他底??物或者共同作用因子的结论［６］，如图１．３所示。这一研宄成果迅速引起了轰动，??许多科学家纷纷效仿，
?第１章绪论???ａｂｅｄ?ｅ??图１．３?Ｃｈａｌｆｉｅ等人利用ＧＦＰ观察到线虫的细胞分化过程。??（图片来源：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｂｅｌｐｒｉｚｅ．ｏｒｇ／ｐｒｉｚｅｓ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／２００８／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／）??尽管科学家们对ＧＦＰ的运用投入了巨大的热情，然而，由于野生型ＧＦＰ的??荧光亮度不够强，而且在异源生物体内的标记效率较低，因此，在实际观测中仍??然存在着较大的局限性。为了解决这些问题，华裔科学家钱永健（ＲｏｇｅｒＹＴｓｉｅｎ）??做出了杰出的贡献。他带领研宄者们详细阐释了?ＧＦＰ的发光原理［７］，并基于ＧＦＰ??的晶体结构，通过定点或随机的基因突变的手段进行改造，开发了一系列功能更??强、更适用于实验观测的荧光蛋白。其中最为广泛使用的就是由ＧＦＰ衍生而来??的增强型绿色焚光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ?ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）以及?Ｅｍｅｒａｌｄ??（祖母绿）。除此之外，他们还发现了蓝色、青色以及黄色的新型荧光蛋白，大??大丰富了荧光蛋白的种类与实用性［８－１１］。后来，研宄人员们又在珊瑚虫和海葵中??发现了红色焚光蛋白（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＦＰ），为荧光蛋白的多色成像提供??了更多的选择［１２，１３］（见图１．４）。??图１．４基于从水母中提取的绿色荧光蛋白和从珊瑚虫中提取的红色荧光蛋白，衍生出的多??色荧光蛋白家族【１１］。??３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]近场光学与近场光学显微镜[J]. 朱星. 北京大学学报(自然科学版). 1997(03)
本文编号：3242511
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１荧光发射过程中的Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ能级图
而多管??水母属会发出绿光而不是蓝光的原因也被Ｍｏｒｉｓｅ等人所揭示出来。原来在水母??体内还存在着另一种绿色焚光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），水母素发射??的蓝光在ＧＦＰ?．的吸收谱内，导致这两种蛋白之间发生了荧光共振能量转移??（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ?ｅｎｅｒｇｙ?ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ），从而刺激?ＧＦＰ?发出绿色焚光，??造成了次级荧光光谱的红移［３］。接下来，Ｓｈｉｍｏｍｕｒ又研宄了?ＧＦＰ的发色团结构??Ｗ，如图１．２所示。与水母素所需要的较为复杂的发光条件不同，当ＧＦＰ暴露在??紫外光或蓝光中，它就能发出绿色的荧光。正是由于这种特性，它引起了许多生??物学家的关注。然而，仅仅将ＧＦＰ提纯出来并不能满足科学要求。要想成功利??用ＧＦＰ进行生物结构的标记、示踪等研究，还需在基因层面上进行解析，让ＧＦＰ??能够在生物体内完成自主表达。??纖??Ａｅｑｕｏｒｅａ?ｖｉｃｔｏｒｉａ??ｈｉｇｈ?ｅｎｅｒｇｙ?ｌｏｗ?ｅｎｅｒｇｙ??■?：ａ：ｉ??图１．２发出绿色黄光的维多利亚多管水母。（图片来源：ｗｗｗ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ）??１９９２年，Ｐｒａｓｈｅｒ等人成功地克隆了?ＧＦＰ的ｃＤＮＡ，为荧光蛋白标签应用于??生物学观察提供了基因层面上的依据。同时，他们也分析了?ＧＦＰ的一级结构，??为进一步理解ＧＦＰ的发光特性提供了帮助［５］。１９９４年，Ｃｈａｌｆｉｅ等人首次将荧光??蛋白克隆到大肠杆菌和线虫中并成功表达，并得出了?ＧＦＰ发光并不需要其他底??物或者共同作用因子的结论［６］，如图１．３所示。这一研宄成果迅速引起了轰动，??许多科学家纷纷效仿，
?第１章绪论???ａｂｅｄ?ｅ??图１．３?Ｃｈａｌｆｉｅ等人利用ＧＦＰ观察到线虫的细胞分化过程。??（图片来源：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｂｅｌｐｒｉｚｅ．ｏｒｇ／ｐｒｉｚｅｓ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／２００８／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／）??尽管科学家们对ＧＦＰ的运用投入了巨大的热情，然而，由于野生型ＧＦＰ的??荧光亮度不够强，而且在异源生物体内的标记效率较低，因此，在实际观测中仍??然存在着较大的局限性。为了解决这些问题，华裔科学家钱永健（ＲｏｇｅｒＹＴｓｉｅｎ）??做出了杰出的贡献。他带领研宄者们详细阐释了?ＧＦＰ的发光原理［７］，并基于ＧＦＰ??的晶体结构，通过定点或随机的基因突变的手段进行改造，开发了一系列功能更??强、更适用于实验观测的荧光蛋白。其中最为广泛使用的就是由ＧＦＰ衍生而来??的增强型绿色焚光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ?ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）以及?Ｅｍｅｒａｌｄ??（祖母绿）。除此之外，他们还发现了蓝色、青色以及黄色的新型荧光蛋白，大??大丰富了荧光蛋白的种类与实用性［８－１１］。后来，研宄人员们又在珊瑚虫和海葵中??发现了红色焚光蛋白（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＦＰ），为荧光蛋白的多色成像提供??了更多的选择［１２，１３］（见图１．４）。??图１．４基于从水母中提取的绿色荧光蛋白和从珊瑚虫中提取的红色荧光蛋白，衍生出的多??色荧光蛋白家族【１１］。??３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]近场光学与近场光学显微镜[J]. 朱星. 北京大学学报(自然科学版). 1997(03)
本文编号：3242511
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