基因组整合与游离质粒联合应用介导阿魏酸酯酶A在马克斯克鲁维酵母中高效分泌表达
发布时间：2021-06-30 19:38
阿魏酸是植物中广泛存在的酚类化学物质,具有抗氧化活性.阿魏酸酯酶能够水解植物细胞壁半纤维素和阿魏酸之间的酯键,释放阿魏酸,在食品、医药、饲料加工等领域具有广泛的应用价值.马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）是一种生长迅速、蛋白分泌能力强的新型食品安全级酵母,具有高效分泌表达菊粉酶的能力,本研究利用基因组菊粉酶位点INU1整合与游离质粒联合应用的方式,在马克斯克鲁维酵母中实现了黑曲霉（Aspergillus niger）阿魏酸酯酶AnFaeA的高效表达,发酵液上清中的酶活达到164.4U/mL.利用马克斯克鲁维酵母重组表达的阿魏酸酯酶能够高效降解玉米芯释放阿魏酸,释放量可达1.81mg/g,并且在β-木聚糖酶的协助下可进一步提高阿魏酸的释放量,达到2.8mg/g.
【文章来源】：复旦学报(自然科学版). 2020,59(05)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
阿魏酸酯酶基因AnfaeA在K.marxianus菊粉酶基因位点INU1的整合
将基因组整合菌株FIM-1(ura3Δ）/inu∶∶AnfaeA、质粒表达菌株FIM-1/pUKDN132-AnfaeA和基因组整合与质粒共表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA分别接种于50mL YD培养基中，在30℃下摇床培养72h后检测上清中阿魏酸酯酶的酶活（图2(a））．整合表达菌株的分泌表达阿魏酸酯酶最低，上清中酶活为0.23U/mL，质粒表达菌株的阿魏酸酯酶表达量是整合表达菌株的2.2倍，上清中阿魏酸酯酶酶活为0.51U/mL，而基因组整合与质粒共表达菌株的阿魏酸酯酶表达量最高，酶活达到0.76U/mL，分别是基因组整合表达菌株和质粒表达菌株的3.3倍和1.5倍．发酵上清的SDS-PAGE检测也表明，基因组整合与质粒共表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA分泌表达的阿魏酸酯酶产量最高（图2(b）），结果说明在质粒表达的基础上通过在基因组中整合表达AnfaeA可以显著提高阿魏酸酯酶的表达水平．进一步在5L发酵罐上进行3株重组表达菌株的阿魏酸酯酶产酶能力分析，结果如图3所示．质粒表达菌株FIM-1/pUKDN132-AnfaeA和基因组整合与质粒共表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA在发酵72h后细胞密度（OD600）约560，而基因组整合表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA发酵72h后的细胞密度（OD600）约500，这可能与菌株的生长速率较慢和种子液的状态有关（图3(a））．发酵罐发酵72h后3种菌株的阿魏酸酯酶产量达到峰值，质粒表达菌株和基因组整合表达菌株的酶活分别为131.3U/mL和7.7U/mL，而基因组整合与质粒共表达菌株的阿魏酸酯酶产量最高，上清中的酶活可达164.4U/mL（图3(b）），分别是前两株菌株产量的1.25倍和21.4倍．发酵液上清的SDS-PAGE检测结果发现基因组整合表达菌株发酵48h才能检测到阿魏酸酯酶蛋白的积累，而质粒表达菌株和基因组整合与质粒共表达菌株在发酵24h时就能够检测到阿魏酸酯酶蛋白的积累，该结果可能与基因组整合表达菌株前期细胞密度增加较慢有关．此外，由于基因组整合表达菌株和基因组整合与质粒共表达菌株中的菊粉酶基因被阿魏酸酯酶基因所置换，因此在它们的发酵上清没有检测到大小约95～130kDa的菊粉酶蛋白条带．
在测试重组阿魏酸酯酶对农业副产物的降解效果前，我们检测了常见农业副产品麦麸、玉米皮、米糠、豆粕和玉米芯中的阿魏酸含量，发现玉米芯的阿魏酸含量最高，为18.8mg/g，为豆粕含量的78倍（图6(a）），因此选用玉米芯作为阿魏酸酯酶水解的底物．含有2g玉米芯的50mL反应体系中加入2U阿魏酸酯酶发酵液降解玉米芯24h，重组阿魏酸酯酶可以从玉米芯中释放出1.81mg/g阿魏酸，加入200Uβ-木聚糖酶能够从玉米芯中释放0.81mg/g阿魏酸，而同时加入2U阿魏酸酯酶和200Uβ-木聚糖酶，阿魏酸释放量可达2.8mg/g，较阿魏酸酯酶单酶水解的释放量提高了55%（图6(b）），说明K.marxianus重组表达的阿魏酸酯酶可以与β-木聚糖酶协同作用，酶降解玉米芯释放阿魏酸．
【参考文献】：
期刊论文
[1]碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵[J]. 望潇文,向腊,徐婷,卢争辉,张桂敏. 生物工程学报. 2017(12)
[2]黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达[J]. 李兵,蔡国林,朱德伟,陆健. 微生物学通报. 2017(05)
[3]黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达[J]. 周燕燕,刘新利,陈静,胡泓宇,侯运华. 微生物学报. 2014(08)
[4]基于筛选标记整合拷贝增加的酿酒酵母外源蛋白高效表达[J]. 张新杰,贺鹏,陶勇,杨毅. 微生物学报. 2013(11)
本文编号：3258362
【文章来源】：复旦学报(自然科学版). 2020,59(05)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
阿魏酸酯酶基因AnfaeA在K.marxianus菊粉酶基因位点INU1的整合
将基因组整合菌株FIM-1(ura3Δ）/inu∶∶AnfaeA、质粒表达菌株FIM-1/pUKDN132-AnfaeA和基因组整合与质粒共表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA分别接种于50mL YD培养基中，在30℃下摇床培养72h后检测上清中阿魏酸酯酶的酶活（图2(a））．整合表达菌株的分泌表达阿魏酸酯酶最低，上清中酶活为0.23U/mL，质粒表达菌株的阿魏酸酯酶表达量是整合表达菌株的2.2倍，上清中阿魏酸酯酶酶活为0.51U/mL，而基因组整合与质粒共表达菌株的阿魏酸酯酶表达量最高，酶活达到0.76U/mL，分别是基因组整合表达菌株和质粒表达菌株的3.3倍和1.5倍．发酵上清的SDS-PAGE检测也表明，基因组整合与质粒共表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA分泌表达的阿魏酸酯酶产量最高（图2(b）），结果说明在质粒表达的基础上通过在基因组中整合表达AnfaeA可以显著提高阿魏酸酯酶的表达水平．进一步在5L发酵罐上进行3株重组表达菌株的阿魏酸酯酶产酶能力分析，结果如图3所示．质粒表达菌株FIM-1/pUKDN132-AnfaeA和基因组整合与质粒共表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA/pUKDN132-AnfaeA在发酵72h后细胞密度（OD600）约560，而基因组整合表达菌株FIM-1/inu∶∶AnfaeA发酵72h后的细胞密度（OD600）约500，这可能与菌株的生长速率较慢和种子液的状态有关（图3(a））．发酵罐发酵72h后3种菌株的阿魏酸酯酶产量达到峰值，质粒表达菌株和基因组整合表达菌株的酶活分别为131.3U/mL和7.7U/mL，而基因组整合与质粒共表达菌株的阿魏酸酯酶产量最高，上清中的酶活可达164.4U/mL（图3(b）），分别是前两株菌株产量的1.25倍和21.4倍．发酵液上清的SDS-PAGE检测结果发现基因组整合表达菌株发酵48h才能检测到阿魏酸酯酶蛋白的积累，而质粒表达菌株和基因组整合与质粒共表达菌株在发酵24h时就能够检测到阿魏酸酯酶蛋白的积累，该结果可能与基因组整合表达菌株前期细胞密度增加较慢有关．此外，由于基因组整合表达菌株和基因组整合与质粒共表达菌株中的菊粉酶基因被阿魏酸酯酶基因所置换，因此在它们的发酵上清没有检测到大小约95～130kDa的菊粉酶蛋白条带．
在测试重组阿魏酸酯酶对农业副产物的降解效果前，我们检测了常见农业副产品麦麸、玉米皮、米糠、豆粕和玉米芯中的阿魏酸含量，发现玉米芯的阿魏酸含量最高，为18.8mg/g，为豆粕含量的78倍（图6(a）），因此选用玉米芯作为阿魏酸酯酶水解的底物．含有2g玉米芯的50mL反应体系中加入2U阿魏酸酯酶发酵液降解玉米芯24h，重组阿魏酸酯酶可以从玉米芯中释放出1.81mg/g阿魏酸，加入200Uβ-木聚糖酶能够从玉米芯中释放0.81mg/g阿魏酸，而同时加入2U阿魏酸酯酶和200Uβ-木聚糖酶，阿魏酸释放量可达2.8mg/g，较阿魏酸酯酶单酶水解的释放量提高了55%（图6(b）），说明K.marxianus重组表达的阿魏酸酯酶可以与β-木聚糖酶协同作用，酶降解玉米芯释放阿魏酸．
【参考文献】：
期刊论文
[1]碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵[J]. 望潇文,向腊,徐婷,卢争辉,张桂敏. 生物工程学报. 2017(12)
[2]黑曲霉阿魏酸酯酶基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达[J]. 李兵,蔡国林,朱德伟,陆健. 微生物学通报. 2017(05)
[3]黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达[J]. 周燕燕,刘新利,陈静,胡泓宇,侯运华. 微生物学报. 2014(08)
[4]基于筛选标记整合拷贝增加的酿酒酵母外源蛋白高效表达[J]. 张新杰,贺鹏,陶勇,杨毅. 微生物学报. 2013(11)
本文编号：3258362
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3258362.html
