酿酒酵母基因组进化的研究进展
发布时间：2021-07-10 22:31
由于细胞代谢和调控网络的复杂性,尤其是对于多基因调控的复杂性状和遗传工具有限的生物系统而言,基因组进化在微生物细胞工厂的构建中起着至关重要的作用。基因组进化通过人为创造多样化性状以及功能筛选的迭代循环,在实验室中模拟且加速自然进化的过程,从而快速获得满足目标需求的进化突变体。酿酒酵母是代谢工程中重要的底盘细胞,全基因组进化是对其进行系统性改造的最有效合成生物学手段之一。本文总结了基因组进化在构建高效的酿酒酵母细胞工厂中的技术进展和应用,包括基因组改组、转座子插入诱变和全局转录机制工程（gTME）等基于随机突变的非理性基因组进化以及诸如酵母寡核苷酸介导的基因组工程（YOGE）,真核基因组多重位点自动改造技术（eMAGE）、RNAi辅助的基因组进化方法 （RAGE）以及基于CRISPR体系的基因组规模改造技术（CHAnGE、MAGIC和MAGESTIC）等可示踪的半理性基因组进化,并简要介绍了基因组进化面临的挑战和高通量筛选方法的发展前景。
【文章来源】：合成生物学. 2020,1(05)
【文章页数】：14 页
【部分图文】：
酿酒酵母基因组进化的主要技术策略
RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种由双链RNA引发的基因沉默途径，存在于多种真核生物中，但酿酒酵母缺乏天然的RNAi机制。有研究报道，通过异源表达芽殖酵母的RNAi相关蛋白Ago1和Dcr1，在酿酒酵母中成功重构了RNAi途径[38]，这使得能够利用RNAi筛选来快速了解和改造工程酵母中的复杂表型[图2(a）]。随后，Si等[31]开发了酿酒酵母中RNAi辅助的基因组进化方法RAGE。在CEN.PK2-1c中引入RNAi途径后，根据酵母基因组DNA片段构建了双链RNA库，并利用该RNA库筛选得到YKU70（与端粒酶功能缺失相关的基因）突变的两个已知和三个未知的抑制基因。同时经过3轮迭代的RNAi筛选，对3个基因PTC6、YPRP84W和t RNAVal(AAC）同时敲降后，显著改善了酿酒酵母对乙酸的耐受性。Xiao等[39]利用RNAi全基因组进化，发现通过下调SIZ1基因的表达水平，可以显著提高酿酒酵母的糠醛耐受性。在RNAi基因组进化的基础上，Si等[32]又开发了酿酒酵母自动化多重基因组进化技术。根据酵母基因组构建包括基因过表达和基因下调的全长c DNA文库，其中基因过表达调控通过全长c DNA的表达实现，基因下调调控通过全长反义RNA的转录（RNAi）实现[图2 (b）]。在CRISPR/Cas的帮助下，通过δ整合的方式将同源供体（donor）整合到酵母基因组上[图2(c）]，并利用自动化平台进行多轮迭代基因组进化提高酿酒酵母乙酸耐受性，最后筛选到的菌株在1.1%乙酸浓度下，4 d内可将20 g/L葡萄糖转化为5.9 g/L乙醇，且整个筛选过程在一个月内就能完成。1.2.4 CHAn GE(CRISPR/Cas9-and homology-directedrepair-assisted genome-scale engineering)
利用CRISPR/Cas技术可以实现基因敲除，而在核酸酶失活的Cas蛋白（d Cas）上融合表达激活域或抑制域可以实现转录激活和抑制[41]。2017年，Lian等[42]开发了三功能CRISPR体系（CRISPR-AID），可以在一个细胞内同时进行转录激活、转录抑制以及基因敲除。其中d Lb Cpf1-VP用于转录激活（CRISPRa),d Sp Cas9-RD1152用于转录抑制（CRISPRi),Sa Cas9用于基因敲除（CRISPRd）。利用CRISPR-AID和寡核苷酸芯片技术，Lian等[34]又发展了多功能全基因组进化技术MAGIC（图3），构建了最全面最多样化的酵母基因组文库。根据酵母基因组对基因敲除、转录激活和转录抑制分别设计不同的g RNA，构建基因敲除、转录激活和转录抑制3个质粒库，将这3个质粒库同时转入酿酒酵母中，通过高通量筛选实现基因组进化，而g RNA可以作为独特的基因条形码，可通过二代测序进行追踪。利用MAGIC技术，他们鉴定了复杂表型（糠醛耐受性和蛋白表面展示）一些之前未知的遗传决定因素。比如在5 mmol/L糠醛浓度下除了筛选到和糠醛耐受性相关的已知靶点SIZ1和SAP30，还筛选到了之前未发现的新的靶点SLX5、NUP133、GPI17和UME1。在SIZ1基因表达水平下调的菌株基础上进行第2轮进化，一些与线粒体功能相关的靶点MRPL32、NAT1等被发现可以提高糠醛耐受性，但这些靶点依赖SIZ1基因的下调。第3轮进化在SIZ1基因表达水平下调及NAT1基因表达水平激活的菌株上进行，发现PDR1基因表达水平的下调可以进一步提高糠醛耐受性。最后经过3轮进化的酵母菌能在17.5 mmol/L糠醛浓度下，两天内消耗掉大部分的葡萄糖（初始浓度20 g/L），且乙醇的最终浓度与对照菌株相当，说明该工程酵母菌株的中心代谢并没有明显改变。1.2.6 MAGESTIC(multiplexed accurate genome editingwith short,trackable,integrated cellular barcodes)
本文编号：3276764
【文章来源】：合成生物学. 2020,1(05)
【文章页数】：14 页
【部分图文】：
酿酒酵母基因组进化的主要技术策略
RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种由双链RNA引发的基因沉默途径，存在于多种真核生物中，但酿酒酵母缺乏天然的RNAi机制。有研究报道，通过异源表达芽殖酵母的RNAi相关蛋白Ago1和Dcr1，在酿酒酵母中成功重构了RNAi途径[38]，这使得能够利用RNAi筛选来快速了解和改造工程酵母中的复杂表型[图2(a）]。随后，Si等[31]开发了酿酒酵母中RNAi辅助的基因组进化方法RAGE。在CEN.PK2-1c中引入RNAi途径后，根据酵母基因组DNA片段构建了双链RNA库，并利用该RNA库筛选得到YKU70（与端粒酶功能缺失相关的基因）突变的两个已知和三个未知的抑制基因。同时经过3轮迭代的RNAi筛选，对3个基因PTC6、YPRP84W和t RNAVal(AAC）同时敲降后，显著改善了酿酒酵母对乙酸的耐受性。Xiao等[39]利用RNAi全基因组进化，发现通过下调SIZ1基因的表达水平，可以显著提高酿酒酵母的糠醛耐受性。在RNAi基因组进化的基础上，Si等[32]又开发了酿酒酵母自动化多重基因组进化技术。根据酵母基因组构建包括基因过表达和基因下调的全长c DNA文库，其中基因过表达调控通过全长c DNA的表达实现，基因下调调控通过全长反义RNA的转录（RNAi）实现[图2 (b）]。在CRISPR/Cas的帮助下，通过δ整合的方式将同源供体（donor）整合到酵母基因组上[图2(c）]，并利用自动化平台进行多轮迭代基因组进化提高酿酒酵母乙酸耐受性，最后筛选到的菌株在1.1%乙酸浓度下，4 d内可将20 g/L葡萄糖转化为5.9 g/L乙醇，且整个筛选过程在一个月内就能完成。1.2.4 CHAn GE(CRISPR/Cas9-and homology-directedrepair-assisted genome-scale engineering)
利用CRISPR/Cas技术可以实现基因敲除，而在核酸酶失活的Cas蛋白（d Cas）上融合表达激活域或抑制域可以实现转录激活和抑制[41]。2017年，Lian等[42]开发了三功能CRISPR体系（CRISPR-AID），可以在一个细胞内同时进行转录激活、转录抑制以及基因敲除。其中d Lb Cpf1-VP用于转录激活（CRISPRa),d Sp Cas9-RD1152用于转录抑制（CRISPRi),Sa Cas9用于基因敲除（CRISPRd）。利用CRISPR-AID和寡核苷酸芯片技术，Lian等[34]又发展了多功能全基因组进化技术MAGIC（图3），构建了最全面最多样化的酵母基因组文库。根据酵母基因组对基因敲除、转录激活和转录抑制分别设计不同的g RNA，构建基因敲除、转录激活和转录抑制3个质粒库，将这3个质粒库同时转入酿酒酵母中，通过高通量筛选实现基因组进化，而g RNA可以作为独特的基因条形码，可通过二代测序进行追踪。利用MAGIC技术，他们鉴定了复杂表型（糠醛耐受性和蛋白表面展示）一些之前未知的遗传决定因素。比如在5 mmol/L糠醛浓度下除了筛选到和糠醛耐受性相关的已知靶点SIZ1和SAP30，还筛选到了之前未发现的新的靶点SLX5、NUP133、GPI17和UME1。在SIZ1基因表达水平下调的菌株基础上进行第2轮进化，一些与线粒体功能相关的靶点MRPL32、NAT1等被发现可以提高糠醛耐受性，但这些靶点依赖SIZ1基因的下调。第3轮进化在SIZ1基因表达水平下调及NAT1基因表达水平激活的菌株上进行，发现PDR1基因表达水平的下调可以进一步提高糠醛耐受性。最后经过3轮进化的酵母菌能在17.5 mmol/L糠醛浓度下，两天内消耗掉大部分的葡萄糖（初始浓度20 g/L），且乙醇的最终浓度与对照菌株相当，说明该工程酵母菌株的中心代谢并没有明显改变。1.2.6 MAGESTIC(multiplexed accurate genome editingwith short,trackable,integrated cellular barcodes)
本文编号：3276764
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