低温几丁质酶基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达及酶学性质表征
发布时间：2021-07-14 11:18
【目的】通过构建假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.DL-6）低温几丁质酶（chitinaseA,chi A;chitinase C, chi C）的重组乳酸克鲁维酵母菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质表征,为低温几丁质酶潜在工业化生产几丁寡糖奠定理论基础。【方法】人工合成密码子优化的几丁质酶基因,构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒（p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C）并用电脉冲法转化到乳酸克鲁维酵母中,实现低温几丁质酶的可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的重组几丁质酶。【结果】成功构建产低温几丁质酶的重组乳酸克鲁维酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶。经SDS-PAGE分析在110 k Da与90 k Da附近出现符合预期大小的蛋白条带。铁氰化钾法测得Chi A和Chi C的酶活分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。最适反应温度分别为20°C和30°C,最适p H分别为8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0时,Chi A和Chi C重组酶较稳定。Chi A和Chi C对胶体几丁质以及粉状底物α-几丁质与β-几丁质...
【文章来源】：微生物学报. 2020,60(01)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
chiA、chiC基因电泳结果
重组表达质粒pKLAC2-chiA及pKLAC2-chiC的酶切鉴定
将K.lactis GG799/pKLAC2和重组菌株K.lactis GG799/p KLAC2-chi A、K.lactis GG799/p KLAC2-chiC在YPD培养基中，30°C、200 r/min培养48 h后离心取上清液经Ni-NTA柱纯化，如图5与图6所示。重组菌株发酵液上清与重组菌K.lactis/pKLAC2相比，重组菌K.lactis GG799/pKLAC2-chiA、K.lactis GG799/pKLAC2-chiC经纯化后在110 kDa和90 kDa附近可见单一蛋白条带，说明在ChiA和ChiC在K.lactis GG799中得到有效的分泌表达。纯化蛋白ChiA与ChiC的蛋白浓度分别为1.26 mg/mL与1.48 mg/mL，酶活力分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。图4.酵母转化子PCR鉴定
【参考文献】：
期刊论文
[1]骆驼凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达[J]. 徐龙龙,刘思彤,任永成,惠丰立. 中国食品学报. 2017(12)
[2]蜡样芽胞杆菌磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中重组表达、纯化及酶学性质分析[J]. 肖超,张梁,李颜颜,辛瑜,陈国安,杨盛荣. 微生物学报. 2017(01)
[3]一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析[J]. 肖景惠,李美玉,孙淼,王晓辉. 微生物学通报. 2016(10)
[4]Purification and characterization of an antifungal chitinase from Bacillus sp. SL-13[J]. Chen Shan. 生物技术世界. 2014(12)
[5]Cloning and Expression of a Chitinase Gene from Serratia marcescens Strain C8-8[J]. Youzhou LIU,Chuping LUO,Yongfeng LIU,Zhiyi CHEN. Agricultural Biotechnology. 2013(03)
[6]重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化[J]. 汤伟,李雅华,刘露,张军霞,咸洪泉. 微生物学报. 2012(03)
[7]Analysis of both chitinase and chitosanase produced by Sphingomonas sp.CJ-5[J]. ZHU Xu-fen, ZHOU Ying, FENG Jun-li (College of Life Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China). Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal）. 2007(11)
本文编号：3284040
【文章来源】：微生物学报. 2020,60(01)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
chiA、chiC基因电泳结果
重组表达质粒pKLAC2-chiA及pKLAC2-chiC的酶切鉴定
将K.lactis GG799/pKLAC2和重组菌株K.lactis GG799/p KLAC2-chi A、K.lactis GG799/p KLAC2-chiC在YPD培养基中，30°C、200 r/min培养48 h后离心取上清液经Ni-NTA柱纯化，如图5与图6所示。重组菌株发酵液上清与重组菌K.lactis/pKLAC2相比，重组菌K.lactis GG799/pKLAC2-chiA、K.lactis GG799/pKLAC2-chiC经纯化后在110 kDa和90 kDa附近可见单一蛋白条带，说明在ChiA和ChiC在K.lactis GG799中得到有效的分泌表达。纯化蛋白ChiA与ChiC的蛋白浓度分别为1.26 mg/mL与1.48 mg/mL，酶活力分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。图4.酵母转化子PCR鉴定
【参考文献】：
期刊论文
[1]骆驼凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达[J]. 徐龙龙,刘思彤,任永成,惠丰立. 中国食品学报. 2017(12)
[2]蜡样芽胞杆菌磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中重组表达、纯化及酶学性质分析[J]. 肖超,张梁,李颜颜,辛瑜,陈国安,杨盛荣. 微生物学报. 2017(01)
[3]一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析[J]. 肖景惠,李美玉,孙淼,王晓辉. 微生物学通报. 2016(10)
[4]Purification and characterization of an antifungal chitinase from Bacillus sp. SL-13[J]. Chen Shan. 生物技术世界. 2014(12)
[5]Cloning and Expression of a Chitinase Gene from Serratia marcescens Strain C8-8[J]. Youzhou LIU,Chuping LUO,Yongfeng LIU,Zhiyi CHEN. Agricultural Biotechnology. 2013(03)
[6]重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化[J]. 汤伟,李雅华,刘露,张军霞,咸洪泉. 微生物学报. 2012(03)
[7]Analysis of both chitinase and chitosanase produced by Sphingomonas sp.CJ-5[J]. ZHU Xu-fen, ZHOU Ying, FENG Jun-li (College of Life Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China). Journal of Zhejiang University（Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal）. 2007(11)
本文编号：3284040
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3284040.html
