生活污水中噬菌体的分离及基因组研究
发布时间：2021-07-18 11:46
城市污水蕴藏着多种潜在的病原体,一旦进入动植物体中会造成各种疾病的产生,而处理后的污水仍可能含有较高的微生物数量。噬菌体是感染细菌等微生物的病毒,具有很强的宿主特异性和多样性。人们开始利用噬菌体的特性进行多个领域的病原体控制研究。实验所需的样品来自北京排水集团清河再生水厂。经过富集分离得到了52株细菌菌株,并以它们为宿主,特异性的分离得到了3株噬菌体。对这些噬菌体的噬菌谱、效价、感染复数和生长曲线等生物学特性进行分析,并利用透射电镜、全基因组测序、拼接和功能注释,对噬菌体基因组结构进行初步探究。本次实验共分离出了52株细菌,将分离纯化后的细菌进行16S rRNA测序后,根据NCBI数据库的序列比对结果确定细菌种类。并以分离出的52株细菌作为潜在宿主来分离噬菌体,最终分别通过Raoultella ornithinolytica、Enterobacter kobei和Citrobacter freundii 3株细菌分离得到了3株对应的噬菌体LW03、EK06、NM19。结果显示3株噬菌体噬菌体LW03、EK06、NM19均可形成透明且边缘清晰的噬菌斑;电镜下观察到3株噬菌体均有规则的正多...
【文章来源】：中国地质大学(北京)北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线
14（10）仔细打开QIAampMinispincolumn，并加入500uLBufferAW1，注意不能弄湿了管盖的边缘，盖紧盖子，静置10mim，再8000rpm离心1min。将QIAampMinispincolumn放到另一个新的2mL收集管中。（11）仔细打开QIAampMinispincolumn，并加入500uLBufferAW2，注意不能弄湿了管盖的边缘，盖紧盖子，静置10mim，再全速离心3min。将QIAampMinispincolumn放到另一个新的2mL收集管中。（12）将QIAampMinispincolumn放置与一个新的2ml收集管中，全速离心1mim，帮助去除残留的BufferAW2。（13）将QIAampMinispincolumn放置与一个新的1.5mLEP管中（自己准备），仔细打开QIAampMinispincolumn盖子，并加入150ulBufferAE或灭菌后的去离子水，注意枪尖不要和膜接触。（14）盖紧盖子，在室温下放置2min，然后在14000rpm下离心1min。（15）重复（13）步骤的操作，使DNA洗脱更完全。将提取的DNA溶液送去北京睿博兴科生物技术有限公司进行16S测序。将公司反馈回的序列通过NCBI数据库中的BLASTn进行序列比对。根据序列相似程度和亲缘性来判断细菌所在种属。2.4结果与讨论在一个城市污水处理厂中，其微生物的数量就可以达到1018个（Woodcocketal.，2006），其种类也极其丰富。通过对污水进行梯度稀释和平板涂布，可以挑取单菌落进行分离纯化（图2-1）。图2-1平板涂布后菌落生长和分布状态
23况等。3.5.4比较基因组和进化分析利用基因组比对软件Mauve2.3.1（Ryooetal.，2018）对多个噬菌体基因组序列进行比较分析，计算基因组序列间的同源性，生成基因组比较的可视化图形。本实验将噬菌体主要衣壳蛋白进行序列比对分析，根据比对结果，利用MEGA（王泽宇等，2017），将各基因的氨基酸序列采用邻接树法（Neighbour-JoiningTree）做进化关系分析绘制系统发生树。3.6结果与讨论3.6.1结果本研究以水样中分离纯化得到的细菌为宿主菌，通过富集、分离和纯化从污水样本中筛选出3株噬菌体，经多次纯化后获得圆形噬菌斑，形状大小均一，透明度高。3株噬菌体的宿主菌分别为：Enterobacterkobei、Citrobacterfreundii以及Raoultellaornithinolytica，将这3株噬菌体分别命名为EK06、NM19和LW03。利用透射扫描电子显微镜对纯化后的3株噬菌体的形态进行观察。3株噬菌体所形成的噬菌斑均为直径2mm左右圆形透亮空斑，如图3-1、3-2所示。图3-1噬菌斑照片
【参考文献】：
期刊论文
[1]藻类加工污水处理方法研究进展[J]. 欧阳乐飞,王林华,张庆起,高焕,阎斌伦. 淮海工学院学报(自然科学版). 2019(03)
[2]噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建[J]. 田栢会,易乐,王习文,李颂,付世杰,王雨田,曲晗,李志萍,王丽萍,张淑华,夏志平. 吉林大学学报(理学版). 2019(04)
[3]大鲵源致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定和药物敏感性[J]. 苏英,吴荣华,申君宇,李伟平,何滔,李云,丁诗华. 淡水渔业. 2019(04)
[4]气单胞菌对水生动物的危害及噬菌体防控研究进展[J]. 戴瑜来,戴杨鑫,马恒甲,黄辉,林启存,许宝青. 水产养殖. 2019(02)
[5]多价噬菌体分离筛选及靶向灭活土壤病原菌的应用研究[J]. 赵远超,叶茂,孔令雅,万金忠,黄丹,张忠云,夏冰,张胜田,冯彦房,孙明明,武俊,胡锋,蒋新,杜良成. 土壤学报. 2019(02)
[6]噬菌体裂解酶对兔膝关节假体周围感染的影响[J]. 程永帅,刘炜洁,于腾波,逄博,戚超,赵夏. 中华实验外科杂志. 2018 (12)
[7]基于宏基因组的城市污水处理厂生物脱氮污泥菌群结构分析[J]. 彭永臻,钱雯婷,王琦,李夕耀,张琼,吴蕾,马斌. 北京工业大学学报. 2019(01)
[8]农村污水现状及处理技术研究进展[J]. 段先月,唐朝春,吴庆庆,许荣明,朱蓓. 水处理技术. 2018(09)
[9]肠球菌脑膜炎1例[J]. 肖科,钟利. 中国感染与化疗杂志. 2018(03)
[10]噬菌体在食品工业中的应用综述[J]. 杨金玉,郭聃洋,尤金娜·戴·盖,辛雪,裘纪莹,陈蕾蕾. 江苏农业科学. 2018(06)
博士论文
[1]宽裂解谱沙门氏菌噬菌体的基因组学分析及其重组内溶素抑菌活性研究[D]. 李萌.中国海洋大学 2014
硕士论文
[1]利用环境DNA探究滇中高原湖泊的鱼类多样性[D]. 罗加山.云南大学 2019
[2]抗药性沙门氏菌及其噬菌体的相互作用关系[D]. 商延.山东大学 2018
[3]多重耐药沙门氏菌广谱噬菌体的分离鉴定及其对小鼠的治疗性研究[D]. 张庆美.南京农业大学 2017
[4]大肠杆菌噬菌体的分离纯化及其在海水养殖中的应用[D]. 陈海阳.厦门大学 2013
本文编号：3289516
【文章来源】：中国地质大学(北京)北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线
14（10）仔细打开QIAampMinispincolumn，并加入500uLBufferAW1，注意不能弄湿了管盖的边缘，盖紧盖子，静置10mim，再8000rpm离心1min。将QIAampMinispincolumn放到另一个新的2mL收集管中。（11）仔细打开QIAampMinispincolumn，并加入500uLBufferAW2，注意不能弄湿了管盖的边缘，盖紧盖子，静置10mim，再全速离心3min。将QIAampMinispincolumn放到另一个新的2mL收集管中。（12）将QIAampMinispincolumn放置与一个新的2ml收集管中，全速离心1mim，帮助去除残留的BufferAW2。（13）将QIAampMinispincolumn放置与一个新的1.5mLEP管中（自己准备），仔细打开QIAampMinispincolumn盖子，并加入150ulBufferAE或灭菌后的去离子水，注意枪尖不要和膜接触。（14）盖紧盖子，在室温下放置2min，然后在14000rpm下离心1min。（15）重复（13）步骤的操作，使DNA洗脱更完全。将提取的DNA溶液送去北京睿博兴科生物技术有限公司进行16S测序。将公司反馈回的序列通过NCBI数据库中的BLASTn进行序列比对。根据序列相似程度和亲缘性来判断细菌所在种属。2.4结果与讨论在一个城市污水处理厂中，其微生物的数量就可以达到1018个（Woodcocketal.，2006），其种类也极其丰富。通过对污水进行梯度稀释和平板涂布，可以挑取单菌落进行分离纯化（图2-1）。图2-1平板涂布后菌落生长和分布状态
23况等。3.5.4比较基因组和进化分析利用基因组比对软件Mauve2.3.1（Ryooetal.，2018）对多个噬菌体基因组序列进行比较分析，计算基因组序列间的同源性，生成基因组比较的可视化图形。本实验将噬菌体主要衣壳蛋白进行序列比对分析，根据比对结果，利用MEGA（王泽宇等，2017），将各基因的氨基酸序列采用邻接树法（Neighbour-JoiningTree）做进化关系分析绘制系统发生树。3.6结果与讨论3.6.1结果本研究以水样中分离纯化得到的细菌为宿主菌，通过富集、分离和纯化从污水样本中筛选出3株噬菌体，经多次纯化后获得圆形噬菌斑，形状大小均一，透明度高。3株噬菌体的宿主菌分别为：Enterobacterkobei、Citrobacterfreundii以及Raoultellaornithinolytica，将这3株噬菌体分别命名为EK06、NM19和LW03。利用透射扫描电子显微镜对纯化后的3株噬菌体的形态进行观察。3株噬菌体所形成的噬菌斑均为直径2mm左右圆形透亮空斑，如图3-1、3-2所示。图3-1噬菌斑照片
【参考文献】：
期刊论文
[1]藻类加工污水处理方法研究进展[J]. 欧阳乐飞,王林华,张庆起,高焕,阎斌伦. 淮海工学院学报(自然科学版). 2019(03)
[2]噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建[J]. 田栢会,易乐,王习文,李颂,付世杰,王雨田,曲晗,李志萍,王丽萍,张淑华,夏志平. 吉林大学学报(理学版). 2019(04)
[3]大鲵源致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定和药物敏感性[J]. 苏英,吴荣华,申君宇,李伟平,何滔,李云,丁诗华. 淡水渔业. 2019(04)
[4]气单胞菌对水生动物的危害及噬菌体防控研究进展[J]. 戴瑜来,戴杨鑫,马恒甲,黄辉,林启存,许宝青. 水产养殖. 2019(02)
[5]多价噬菌体分离筛选及靶向灭活土壤病原菌的应用研究[J]. 赵远超,叶茂,孔令雅,万金忠,黄丹,张忠云,夏冰,张胜田,冯彦房,孙明明,武俊,胡锋,蒋新,杜良成. 土壤学报. 2019(02)
[6]噬菌体裂解酶对兔膝关节假体周围感染的影响[J]. 程永帅,刘炜洁,于腾波,逄博,戚超,赵夏. 中华实验外科杂志. 2018 (12)
[7]基于宏基因组的城市污水处理厂生物脱氮污泥菌群结构分析[J]. 彭永臻,钱雯婷,王琦,李夕耀,张琼,吴蕾,马斌. 北京工业大学学报. 2019(01)
[8]农村污水现状及处理技术研究进展[J]. 段先月,唐朝春,吴庆庆,许荣明,朱蓓. 水处理技术. 2018(09)
[9]肠球菌脑膜炎1例[J]. 肖科,钟利. 中国感染与化疗杂志. 2018(03)
[10]噬菌体在食品工业中的应用综述[J]. 杨金玉,郭聃洋,尤金娜·戴·盖,辛雪,裘纪莹,陈蕾蕾. 江苏农业科学. 2018(06)
博士论文
[1]宽裂解谱沙门氏菌噬菌体的基因组学分析及其重组内溶素抑菌活性研究[D]. 李萌.中国海洋大学 2014
硕士论文
[1]利用环境DNA探究滇中高原湖泊的鱼类多样性[D]. 罗加山.云南大学 2019
[2]抗药性沙门氏菌及其噬菌体的相互作用关系[D]. 商延.山东大学 2018
[3]多重耐药沙门氏菌广谱噬菌体的分离鉴定及其对小鼠的治疗性研究[D]. 张庆美.南京农业大学 2017
[4]大肠杆菌噬菌体的分离纯化及其在海水养殖中的应用[D]. 陈海阳.厦门大学 2013
本文编号：3289516
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