酪蛋白激酶Ⅱ对蛋白酶体活性的抑制作用
发布时间：2021-07-27 02:05
蛋白酶体（Proteasome）是细胞内蛋白质降解的主要途径之一,其主要功能是降解受损伤或错误折叠的蛋白质。有研究报道酪蛋白激酶II（CKⅡ）磷酸化20S蛋白酶体的C8（α7）亚基对26S蛋白酶体的稳定性有重要作用,但对于蛋白酶体活性的影响不甚清楚,本文旨在探讨CKⅡ对蛋白酶体活性的调节作用。方法:我们主要从细胞内和细胞外两方面着手来研究CKⅡ对蛋白酶体活性的调节作用,（1）探讨CKⅡ对细胞内蛋白酶体活性的作用,首先用CKⅡ抑制剂（1uM DMAT、5 uM CX-4945、10 uM TBB）处理NRK细胞,16 h后收集细胞制备细胞核提取物,使用人工合成的荧光肽底物Suc-LLVY-AMC和Boc-LSTR-AMC分别测量不同核提取物中的胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样肽酶活性;CKⅡ抑制剂短时间处理NRK或293T细胞,检测细胞核提取物中的两种肽酶活性;CKⅡ抑制剂（0.5/1 uM DMAT,0.25/0.5/1/5 uM CX-4945,1/5/10 uM TBB）分别处理NRK或293T细胞过夜,Western blot检测细胞内泛素化蛋白的含量;将GFP-CL1质粒转染到293...
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线
图 2-1 酪蛋白激酶 II 抑制剂处理 NRK 细胞。用倒置相差显微镜 10X 物镜拍照，（a）DMSO 处理 NRK 细胞 16 h 后，细胞形态良好；（b）1 uM DMAT 处理 NRK细胞 16 h 后，细胞形态良好；（c）5 uM CX-4945 处理 NRK 细胞 16 h 后，细胞形态良好；（d）10 uM TBB 处理 NRK 细胞 16 h 后，细胞形态良好。细胞拍摄取照后，制备 NRK 细胞核提取物，使用人工合成的荧光肽底物Suc-LLVY-AMC和Boc-LSTR-AMC分别测量胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样肽酶活性。如图 2-2 a 和 b 所示，相比对照组，给药组（DMAT、CX-4945、TBB）荧光强度（FIU）明显升高，经统计学分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。其中DMAT 和 CX-4945 组荧光强度（FIU）均高于 TBB 组，经统计学分析，与 TBB 组相比，DMAT 和 CX-4945 组差异均有统计学意义（P<0.01），表明 CKII 抑制剂长时间处理 NRK 细胞能激活细胞核提取物内胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样活性。当 NRK 细胞汇合度达 80%以上，对细胞给予 CKII 抑制剂 0.5 uM DMAT、0.5uM CX-4945、5 uM TBB 药物刺激，分别处理 2h、4h、30 min 后，检测核提取物内的肽酶活性。如图 2-2 c 和 d 所示，结果显示三种抑制剂处理后荧光强度（FIU）
（c） （d）图 2-2 酪蛋白激酶 II 抑制剂激活 NRK 细胞内的肽酶活性。与对照组相比，1 uMDMAT、5 uM CX-4945、10 uM TBB 分别处理 NRK 细胞 16 h，（a）细胞核蛋白与 Suc-LLVY-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；（b）细胞核蛋白与Boc-LSTR-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；与对照组相比，0.5 uM DMAT处理 NRK 细胞 2 h，0.5 uM CX-4945 处理 NRK 细胞 4 h，5 uM TBB 处理 NRK细胞 30 min，（c）细胞核蛋白与 Suc-LLVY-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；（d）细胞核蛋白与 Boc-LSTR-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；荧光强度（FIU）反映了肽酶活性，Suc-LLVY-AMC 底物对应胰凝乳蛋白酶样活性，Boc-LSTR-AMC 底物对应胰蛋白酶样活性。（*P <0.05，**P <0.01，*** P<0.001，**** P <0.0001，n = 3）2.4.2 酪蛋白激酶 II 抑制剂激活 293T 细胞内的肽酶活性用 CKII 抑制剂 0.5 uM DMAT、0.25 uM CX-4945、1 uM TBB 处理 293T 细胞，
本文编号：3304845
【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线
图 2-1 酪蛋白激酶 II 抑制剂处理 NRK 细胞。用倒置相差显微镜 10X 物镜拍照，（a）DMSO 处理 NRK 细胞 16 h 后，细胞形态良好；（b）1 uM DMAT 处理 NRK细胞 16 h 后，细胞形态良好；（c）5 uM CX-4945 处理 NRK 细胞 16 h 后，细胞形态良好；（d）10 uM TBB 处理 NRK 细胞 16 h 后，细胞形态良好。细胞拍摄取照后，制备 NRK 细胞核提取物，使用人工合成的荧光肽底物Suc-LLVY-AMC和Boc-LSTR-AMC分别测量胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样肽酶活性。如图 2-2 a 和 b 所示，相比对照组，给药组（DMAT、CX-4945、TBB）荧光强度（FIU）明显升高，经统计学分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。其中DMAT 和 CX-4945 组荧光强度（FIU）均高于 TBB 组，经统计学分析，与 TBB 组相比，DMAT 和 CX-4945 组差异均有统计学意义（P<0.01），表明 CKII 抑制剂长时间处理 NRK 细胞能激活细胞核提取物内胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样活性。当 NRK 细胞汇合度达 80%以上，对细胞给予 CKII 抑制剂 0.5 uM DMAT、0.5uM CX-4945、5 uM TBB 药物刺激，分别处理 2h、4h、30 min 后，检测核提取物内的肽酶活性。如图 2-2 c 和 d 所示，结果显示三种抑制剂处理后荧光强度（FIU）
（c） （d）图 2-2 酪蛋白激酶 II 抑制剂激活 NRK 细胞内的肽酶活性。与对照组相比，1 uMDMAT、5 uM CX-4945、10 uM TBB 分别处理 NRK 细胞 16 h，（a）细胞核蛋白与 Suc-LLVY-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；（b）细胞核蛋白与Boc-LSTR-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；与对照组相比，0.5 uM DMAT处理 NRK 细胞 2 h，0.5 uM CX-4945 处理 NRK 细胞 4 h，5 uM TBB 处理 NRK细胞 30 min，（c）细胞核蛋白与 Suc-LLVY-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；（d）细胞核蛋白与 Boc-LSTR-AMC 底物反应，荧光强度明显升高；荧光强度（FIU）反映了肽酶活性，Suc-LLVY-AMC 底物对应胰凝乳蛋白酶样活性，Boc-LSTR-AMC 底物对应胰蛋白酶样活性。（*P <0.05，**P <0.01，*** P<0.001，**** P <0.0001，n = 3）2.4.2 酪蛋白激酶 II 抑制剂激活 293T 细胞内的肽酶活性用 CKII 抑制剂 0.5 uM DMAT、0.25 uM CX-4945、1 uM TBB 处理 293T 细胞，
本文编号：3304845
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3304845.html
