拟南芥EBP1蛋白与RNA相互作用的初步研究
发布时间：2021-07-30 22:43
基因表达调控是现代分子生物学研究的热点话题,随着研究手段的不断成熟,其RNA转录后调控已成为备受关注的领域。RNA结合蛋白（RBPs）是转录后调控的关键因子,参与RNA可变剪切、RNA稳定、翻译等多个过程的调控。ErbB3绑定蛋白（EBP1）是结构功能高度保守的RNA结合蛋白,可与rRNA、tRNA、mRNA等多种RNA结合,参与调控核糖体生物生成、蛋白质翻译多个过程,但目前已报道的靶RNA甚少,对靶RNA的作用机制目前仍不清楚。通过生物信息学分析发现拟南芥EBP1结合RNA的保守结构域,并在体外可直接结合"GUCUCUCACUGCGACGGCUU"序列;通过RNA免疫共沉淀实验找到了3个靶mRNA（AT1G24792、AT3G25211、AT3G24320）;结合核糖体提取及虫草素处理实验发现EBP1可显著调控特定靶mRNA的稳定性及其翻译速率。研究结果不仅证实拟南芥EBP1具有结合RNA的功能,还显示其参与调控靶RNA的转录后事件,为进一步研究EBP1在转录后调控的生物学机制奠定基础。
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(06)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
EBP1蛋白结构域分析
表2 样品浓度及吸光值 Sample OD260 OD260/280 RNA/(μg·mL-1) 显著性(与GSTAgarose相比) GST Agarose 0.0191 1.9256 0.0412 IP:GST 0.0213 1.9113 0.0448 P＞0.05 IP:EBP1-GST 0.0413 2.0511 0.1324 **P＜0.01进一步表达并纯化了EBP1-GST蛋白(图2-B),然后合成FITC修饰的探针“GUCUCUCACU-GCGACGGCUU”(Probes)以及不修饰的探针“GU-CUCUCACUGCGACGGCUU”(Competitor),通过与EBP1-GST、GST蛋白孵育,同时用50倍和100倍的不修饰的特异性探针(Competitor)进行RNA-EMSA实验。实验结果表明:对照组GST纯化柱(第一泳道)和GST(第二泳道)蛋白与探针孵育的泳道没有出现迁移的电泳条带,EBP1-GST与探针孵育泳道(第三泳道),显示出明显迁移的电泳条带,且条带的强度随着竞争性探针(Competitor)浓度的升高而减弱(第四、五泳道)。表明GST蛋白不能结合RNA,而EBP1蛋白可以直接绑定“GUCUCUCA-CUGCGACGGCUU”这一RNA序列(图2-C)。
为了研究EBP1对靶RNA转录后事件的调控,首先我们分析了EBP1对基因AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211在RNA稳定性方面的影响。利用虫草素这种转录抑制剂,结合qRT-PCR技术检测靶RNA的降解速度,进而分析RNA的稳定性。于是对Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株用虫草素处理后,进行qRT-PCR检测。ATHSPRO2基因是一个已被报道mRNA不稳定的基因,虫草素处理后ATHSPRO2 mRNA会迅速降解,证明虫草素处理有效(图4-A)。Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株在虫草素处理0 min时这3个靶基因的mRNA含量均为1。相对于0 min mRNA含量,EBP1突变后AT1G24792 mRNA的含量在虫草素处理30 min、45 min分别为0.574 7、0.218,而对照组Col-0中AT1G24792 mRNA分别是0.33、0.03,过表达EBP1-GFP AT1G24792 mRNA含量在30 min、45 min分别为0.301 58、0.046 03(图4-B);EBP1突变后AT3G24320 mRNA在处理15 min、30 min后含量分别为0.222、0.191 1,对照组Col-0中AT3G24320 mRNA在虫草素处理15 min、30 min时的相对含量是0.642 8、0.33,过表达EBP1-GFP AT3G24320 mRNA含量在15 min、30 min分别为0.202 5、0.13(图4-C);EBP1突变后虫草素处理15 min、45 min后AT1G25211 mRNA相对含量分别是0.807 3、0.218 4,Col-0被虫草素处理15 min、45 min后AT1G25211 mRNA相对含量分别是0.802 0、0.263 9(图4-D)。以上数据表明:EBP1促进AT1G24792、AT3G24320 mRNA的降解,而对AT1G25211mRNA的稳定性没有影响。进一步我们通过qRT-PCR手段检测Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP植物中靶mRNA的含量(图4-E-G)。数据显示AT1G24792 mRNA在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP的相对含量为1.660 57、4.297 34、5.955 5、1.904 86、0.873 17,即AT1G24792 mRNA在ebp1-1、ebp1-2中明显增多(P<0.05),而在过表达中mRNA没有显著改变(P>0.05)(图4-E)。AT3G24320的mRNA相对含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分别为1.034 72、2.661 91、2.310 78、4.561 03、0.392 15,即EBP1突变后AT3G24320 mRNA的含量增加(P<0.05),EBP1过表达AT3G24320 mRNA的含量减少(P<0.05)(图4-F)。AT1G25211的mRNA相对含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分别为1、0.567 20、0.426 91、0.659 82、1.466 62,表明EBP1对AT1G25211的mRNA含量没有显著影响(P>0.05)(图4-G)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物RNA结合蛋白研究进展[J]. 张在宝,李婉杰,李九丽,张弛,胡梦辉,程琳,袁红雨. 中国农业科学. 2018(21)
[2]RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术[J]. 陈伟,许馨,孙绍光. 中国生物化学与分子生物学报. 2017(02)
[3]细菌RNA结合蛋白Hfq研究进展[J]. 郭英飞,袁玖云,王玉飞,崔明全. 解放军预防医学杂志. 2015(05)
[4]RNA结合蛋白调节mRNA稳定性的作用机制[J]. 高媛,马大鹏,肖建华. 微生物学免疫学进展. 2012(02)
本文编号：3312261
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(06)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
EBP1蛋白结构域分析
表2 样品浓度及吸光值 Sample OD260 OD260/280 RNA/(μg·mL-1) 显著性(与GSTAgarose相比) GST Agarose 0.0191 1.9256 0.0412 IP:GST 0.0213 1.9113 0.0448 P＞0.05 IP:EBP1-GST 0.0413 2.0511 0.1324 **P＜0.01进一步表达并纯化了EBP1-GST蛋白(图2-B),然后合成FITC修饰的探针“GUCUCUCACU-GCGACGGCUU”(Probes)以及不修饰的探针“GU-CUCUCACUGCGACGGCUU”(Competitor),通过与EBP1-GST、GST蛋白孵育,同时用50倍和100倍的不修饰的特异性探针(Competitor)进行RNA-EMSA实验。实验结果表明:对照组GST纯化柱(第一泳道)和GST(第二泳道)蛋白与探针孵育的泳道没有出现迁移的电泳条带,EBP1-GST与探针孵育泳道(第三泳道),显示出明显迁移的电泳条带,且条带的强度随着竞争性探针(Competitor)浓度的升高而减弱(第四、五泳道)。表明GST蛋白不能结合RNA,而EBP1蛋白可以直接绑定“GUCUCUCA-CUGCGACGGCUU”这一RNA序列(图2-C)。
为了研究EBP1对靶RNA转录后事件的调控,首先我们分析了EBP1对基因AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211在RNA稳定性方面的影响。利用虫草素这种转录抑制剂,结合qRT-PCR技术检测靶RNA的降解速度,进而分析RNA的稳定性。于是对Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株用虫草素处理后,进行qRT-PCR检测。ATHSPRO2基因是一个已被报道mRNA不稳定的基因,虫草素处理后ATHSPRO2 mRNA会迅速降解,证明虫草素处理有效(图4-A)。Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株在虫草素处理0 min时这3个靶基因的mRNA含量均为1。相对于0 min mRNA含量,EBP1突变后AT1G24792 mRNA的含量在虫草素处理30 min、45 min分别为0.574 7、0.218,而对照组Col-0中AT1G24792 mRNA分别是0.33、0.03,过表达EBP1-GFP AT1G24792 mRNA含量在30 min、45 min分别为0.301 58、0.046 03(图4-B);EBP1突变后AT3G24320 mRNA在处理15 min、30 min后含量分别为0.222、0.191 1,对照组Col-0中AT3G24320 mRNA在虫草素处理15 min、30 min时的相对含量是0.642 8、0.33,过表达EBP1-GFP AT3G24320 mRNA含量在15 min、30 min分别为0.202 5、0.13(图4-C);EBP1突变后虫草素处理15 min、45 min后AT1G25211 mRNA相对含量分别是0.807 3、0.218 4,Col-0被虫草素处理15 min、45 min后AT1G25211 mRNA相对含量分别是0.802 0、0.263 9(图4-D)。以上数据表明:EBP1促进AT1G24792、AT3G24320 mRNA的降解,而对AT1G25211mRNA的稳定性没有影响。进一步我们通过qRT-PCR手段检测Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP植物中靶mRNA的含量(图4-E-G)。数据显示AT1G24792 mRNA在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP的相对含量为1.660 57、4.297 34、5.955 5、1.904 86、0.873 17,即AT1G24792 mRNA在ebp1-1、ebp1-2中明显增多(P<0.05),而在过表达中mRNA没有显著改变(P>0.05)(图4-E)。AT3G24320的mRNA相对含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分别为1.034 72、2.661 91、2.310 78、4.561 03、0.392 15,即EBP1突变后AT3G24320 mRNA的含量增加(P<0.05),EBP1过表达AT3G24320 mRNA的含量减少(P<0.05)(图4-F)。AT1G25211的mRNA相对含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分别为1、0.567 20、0.426 91、0.659 82、1.466 62,表明EBP1对AT1G25211的mRNA含量没有显著影响(P>0.05)(图4-G)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物RNA结合蛋白研究进展[J]. 张在宝,李婉杰,李九丽,张弛,胡梦辉,程琳,袁红雨. 中国农业科学. 2018(21)
[2]RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术[J]. 陈伟,许馨,孙绍光. 中国生物化学与分子生物学报. 2017(02)
[3]细菌RNA结合蛋白Hfq研究进展[J]. 郭英飞,袁玖云,王玉飞,崔明全. 解放军预防医学杂志. 2015(05)
[4]RNA结合蛋白调节mRNA稳定性的作用机制[J]. 高媛,马大鹏,肖建华. 微生物学免疫学进展. 2012(02)
本文编号：3312261
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