磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的异源表达和应用
发布时间：2021-08-06 07:45
旨在研究大肠杆菌产磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C （PI-PLC）的发酵表达和分离纯化,探究PI-PLC酶切GPI锚定蛋白的效果。依据NCBI数据库中蜡样芽孢杆菌的PI-PLC的基因序列,按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化,合成相应基因序列并构建基因表达载体pGEX-6P-1-PI-PLC。将重组质粒转入受体菌E.cOli BL21 （DE3）中,通过加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导目的基因PI-PLC表达。经检测,含有GST标签的PI-PLC融合蛋白以可溶蛋白形式存在于菌体破碎上清,分子量约为61 kDa,与预期相符。初步优化诱导表达条件后,发现最佳诱导表达条件为:以接种量5%接种体积分数接种,待菌体生长至OD600nm达到0.5,在16℃条件下以0.3 mmol/L浓度IPTG诱导24 h。利用GST标签对蛋白进行纯化,纯化后的PI-PLC质量浓度为0.52 mg/mL,比酶活为1 322.5 U/mg。利用PI-PLC酶液对哺乳动物细胞表面的模式GPI锚定蛋白CD59进行酶切,酶切作用显著。因此,下一步可以将PI-PLC融合蛋白应用于细胞生物...
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(01)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的诱导表达和纯化
在最佳条件下发酵PI-PLC并纯化，纯化后酶的质量浓度为0.52 mg/mL,20μL纯化酶液含有酶活为14 U，经计算比酶活为1 322.5 U/mg。2.6 用PI-PLC处理膀胱癌细胞
国外对磷脂酶C的基因序列、结构、功能、酶学性质及应用等相关研究开始较早，对细菌来源的磷脂酶C在不同体系内的克隆表达和其在工业和医学方面的应用也有报道[14-15]。相比较而言，国内对细菌来源的磷脂酶C尤其是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的研究较少，主要集中在磷脂酶C在油脂脱胶、饲料抗虫等方面的应用研究。2016年，汤先泽[16]对磷脂酰肌醇进行了异源表达，并对其粗酶液的抗鸡球虫效果进行了初步分析；2019年，邹全等[17]对磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C在枯草芽孢杆菌中进行表达，并利用其粗酶液对两种酶的酶学性质进行了分析并应用于油脂脱胶，然而，对磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的纯化及其酶活性研究较少。同时，GPI锚定的形式可以使细胞膜表面结合更多蛋白[18]，其中哺乳细胞中的一些细胞粘附分子、淋巴细胞分化抗原、补体调节蛋白等具有一定功能性的蛋白通过GPI锚定的形式存于细胞膜表面[19]，这些蛋白和哺乳动物的很多生理过程息息相关[20]，然而对GPI锚定蛋白的研究还远远不够。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C可以专一作用于GPI锚定蛋白的磷脂酰肌醇的磷酸二酯键，进而使GPI锚定蛋白从细胞膜上释放下来。表达和纯化高效的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，从而将其更好地应用于对GPI锚定蛋白的研究与鉴定中，可为研究GPI锚定蛋白的生物学功能等提供有效帮助。由于本实验中PI-PLC来源于蜡状芽孢杆菌，其结构与哺乳动物体内切割GPI锚定蛋白的酶结构具有相似性，且不作为毒力因子[21]，因此后续工作可把磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C在细胞生物学实验中进行应用。4 结论
【参考文献】：
期刊论文
[1]磷脂酰胆碱特异性和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C酶学性质及其在油脂脱胶中的应用[J]. 邹权,陈圣,严明. 生物加工过程. 2019(02)
[2]磷脂酶C基因家族研究进展[J]. 王法微,王骐,邓宇,董金晔,王南,李晓薇,李海燕. 生物技术通报. 2014(12)
[3]磷脂酶C用于大豆油脱胶的工艺优化[J]. 杨娇,金青哲,王兴国. 中国油脂. 2012(12)
硕士论文
[1]磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因的克隆、表达及抗鸡球虫效果的初步研究[D]. 汤先泽.齐鲁工业大学 2016
本文编号：3325377
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(01)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的诱导表达和纯化
在最佳条件下发酵PI-PLC并纯化，纯化后酶的质量浓度为0.52 mg/mL,20μL纯化酶液含有酶活为14 U，经计算比酶活为1 322.5 U/mg。2.6 用PI-PLC处理膀胱癌细胞
国外对磷脂酶C的基因序列、结构、功能、酶学性质及应用等相关研究开始较早，对细菌来源的磷脂酶C在不同体系内的克隆表达和其在工业和医学方面的应用也有报道[14-15]。相比较而言，国内对细菌来源的磷脂酶C尤其是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的研究较少，主要集中在磷脂酶C在油脂脱胶、饲料抗虫等方面的应用研究。2016年，汤先泽[16]对磷脂酰肌醇进行了异源表达，并对其粗酶液的抗鸡球虫效果进行了初步分析；2019年，邹全等[17]对磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C在枯草芽孢杆菌中进行表达，并利用其粗酶液对两种酶的酶学性质进行了分析并应用于油脂脱胶，然而，对磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的纯化及其酶活性研究较少。同时，GPI锚定的形式可以使细胞膜表面结合更多蛋白[18]，其中哺乳细胞中的一些细胞粘附分子、淋巴细胞分化抗原、补体调节蛋白等具有一定功能性的蛋白通过GPI锚定的形式存于细胞膜表面[19]，这些蛋白和哺乳动物的很多生理过程息息相关[20]，然而对GPI锚定蛋白的研究还远远不够。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C可以专一作用于GPI锚定蛋白的磷脂酰肌醇的磷酸二酯键，进而使GPI锚定蛋白从细胞膜上释放下来。表达和纯化高效的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，从而将其更好地应用于对GPI锚定蛋白的研究与鉴定中，可为研究GPI锚定蛋白的生物学功能等提供有效帮助。由于本实验中PI-PLC来源于蜡状芽孢杆菌，其结构与哺乳动物体内切割GPI锚定蛋白的酶结构具有相似性，且不作为毒力因子[21]，因此后续工作可把磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C在细胞生物学实验中进行应用。4 结论
【参考文献】：
期刊论文
[1]磷脂酰胆碱特异性和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C酶学性质及其在油脂脱胶中的应用[J]. 邹权,陈圣,严明. 生物加工过程. 2019(02)
[2]磷脂酶C基因家族研究进展[J]. 王法微,王骐,邓宇,董金晔,王南,李晓薇,李海燕. 生物技术通报. 2014(12)
[3]磷脂酶C用于大豆油脱胶的工艺优化[J]. 杨娇,金青哲,王兴国. 中国油脂. 2012(12)
硕士论文
[1]磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因的克隆、表达及抗鸡球虫效果的初步研究[D]. 汤先泽.齐鲁工业大学 2016
本文编号：3325377
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3325377.html
