Au@Pt纳米酶的泡沫免疫分析法和免疫磁珠酶荧光增强免疫层析法检测E. coli O157:H7
发布时间：2021-10-26 19:46
大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7,E.coli O157:H7）是一种非常重要的食源性致病菌。目前已有标准和快速的检测技术,但仍存在较多可提升的空间。融合多领域新知识、材料和技术,研发出多方面性能良好,特别是能够同时实现定性定量分析的技术,对于快速检测具有重大意义。近年来,气体免疫传感器因其具有环保、灵敏、简便等优点,逐渐受到相关科研人员的关注;新型多功能纳米酶亦是在快速检测领域备受重视。基于此,本课题研发了3种操作简单、检测成本低、检测结果准确且具有创新性的快速检测方法,均很好地实现了E.coli O157:H7的定性定量检测。具体研究内容如下:1、基于Au@Pt纳米酶ELISA/H2O2→O2↑/SDS免疫夹心泡沫法定性/量快速检测E.coli O157:H7本章通过将泡沫生成反应指示系统与病原体识别组分相结合,利用低成本的测量工具-直尺直接测量泡沫高度的变化,研发了一种泡沫免疫分析技术,可同时实现定性定量检测E.coli O157:H7。用修饰了鼠抗E.coli O157...
【文章来源】：浙江工商大学浙江省
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
过氧化氢酶与PtNPs表观周转数（kcat）比较
21细菌浓度，菌落单位为CFU·mL-1。经过两次活化的培养物4C下以6000rpm离心10min，用5mL含0.5%甲醛的生理盐水作为灭活细菌制剂，37C下灭活上述细菌悬浮液12h，这确保了实验室人员的人身安全。随后将其离心并重新分散在5mL生理盐水中，并储存在4°C环境下。通过灭活细菌细胞来评估所开发的泡沫免疫测定的条件和性能。同样地，用C.sakazakii，C.freundii，L.monocytogenes，S.putrefaciens，B.subtilis和B.cereus用于对照实验。2.1.7免疫夹心泡沫法实验流程图2.1制备（A）Au@PtNP，（B）mAb2-Au@Pt/SiO2NP，（C）夹心免疫反应检测E.coliO157:H7和（D）泡沫法快速定量检测E.coliO157:H7的工作原理图Fig.2.1Aschematicillustrationofthefabricationprocessof(A)Au@PtNP,(B)mAb2-Au@Pt/SiO2NP,(C)sandwichimmunereactionfordetectionofE.coliO157:H7usingMIcsand(D)mAb2-Au@Pt/SiO2NPandworkingprincipleoffoamimmunoassayforrapidandquantitativedetectionofE.coliO157:H7免疫夹心泡沫法测定过程见图2.1C和图2.1D。首先，将30μLMIc（10mg·mL-1）与3mLE.coliO157:H7选择性增菌液混合，并在37C温和振荡下孵育30min，然后将复合物用PBST洗涤3次，加入5μLmAb2-Au@Pt/SiO2NP并在37C下再孵育30min。
22同样的，将复合物用PBST洗涤3次并用磁铁分离，然后用50μLPBS重悬后，将夹心复合物转移到96孔板中。将60μL30%H2O2溶液和50μL16mmol·mL-1SDS加入到孔中，迅速用硅胶塞密封，立即插入亚克力细管。在室温下反应25min后，用尺子测量亚克力细管中O2与SDS所形成泡沫的高度，所有数据均通过3次平行测量分析获得。2.2结果和讨论2.2.1免疫夹心泡沫法的原理免疫夹心泡沫法的检测原理如图2.1所示，定量检测只用了96孔板，硅胶塞和亚克力细管。具体装置如图2.1D所示，用硅胶塞密封孔，然后插入亚克力细管。该夹心型泡沫免疫测定法由MIc选择性富集和分离待测菌，并与mAb2-Au@Pt/SiO2NP结合形成夹心免疫结构。Au@PtNP具有将H2O2分解成H2O和O2的优异催化能力，产生的O2被表面活性剂SDS捕获并转化为泡沫，继而通过压力将泡沫推进亚克力细管中，产生肉眼可见并方便测量的高度变化。泡沫的高度与待测目的菌E.coliO157:H7的浓度直接相关，通过测量泡沫的高度来实现定性定量检测目标物的浓度。2.2.2MNP和Au@Pt/SiO2NP的表征图2.2（A）磁珠的透射电镜图；（B）磁珠的红外光谱图Fig.2.2(A)TheTEMimageofMNP;(B)TheFTIRspectraofMNP
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中的大肠杆菌O157:H[J]. 赵远洋,王瑾,林丽萍,郜彦彦,吴国平. 中国食品学报. 2019(03)
[2]乳胶凝集试验快速检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究[J]. 罗玲,罗青平,温国元,王红琳,汪宏才,张腾飞,艾地云,卢琴,张蓉蓉,邵华斌. 中国家禽. 2017(06)
[3]免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157:H7[J]. 顾培科. 大家健康(学术版). 2015(02)
[4]生物传感器检测食源性大肠杆菌O157:H7研究新进展[J]. 刘慧玲,吕敬章,朱智壕,范放,张恒. 食品安全质量检测学报. 2013(06)
[5]食源性致病菌快速检测技术研究进展[J]. 封莉,黄继超,刘欣,黄明,周光宏. 食品科学. 2012(21)
[6]基于甘露糖功能化的水凝胶用于E.coli O157:H7的检测[J]. 周丽霞,何定庚,何晓晓,卿志和,王柯敏,曹杰. 高等学校化学学报. 2012(04)
[7]新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用[J]. 刘道峰,邓省亮,赖卫华. 食品与机械. 2011(06)
[8]一个新的测定Fenton反应产生的·OH及清除的荧光方法[J]. 谷学新,邰超,邹洪,郭启华. 分析科学学报. 2002(06)
[9]水杨基荧光酮荧光法测定钴Ⅱ-过氧化氢体系产生的羟自由基[J]. 任凤莲,吴南,司士辉. 分析化学. 2001(01)
博士论文
[1]快速检测农产品中大肠杆菌O157：H7的生物传感方法与仪器研究[D]. 王一娴.浙江大学 2013
本文编号：3460097
【文章来源】：浙江工商大学浙江省
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
过氧化氢酶与PtNPs表观周转数（kcat）比较
21细菌浓度，菌落单位为CFU·mL-1。经过两次活化的培养物4C下以6000rpm离心10min，用5mL含0.5%甲醛的生理盐水作为灭活细菌制剂，37C下灭活上述细菌悬浮液12h，这确保了实验室人员的人身安全。随后将其离心并重新分散在5mL生理盐水中，并储存在4°C环境下。通过灭活细菌细胞来评估所开发的泡沫免疫测定的条件和性能。同样地，用C.sakazakii，C.freundii，L.monocytogenes，S.putrefaciens，B.subtilis和B.cereus用于对照实验。2.1.7免疫夹心泡沫法实验流程图2.1制备（A）Au@PtNP，（B）mAb2-Au@Pt/SiO2NP，（C）夹心免疫反应检测E.coliO157:H7和（D）泡沫法快速定量检测E.coliO157:H7的工作原理图Fig.2.1Aschematicillustrationofthefabricationprocessof(A)Au@PtNP,(B)mAb2-Au@Pt/SiO2NP,(C)sandwichimmunereactionfordetectionofE.coliO157:H7usingMIcsand(D)mAb2-Au@Pt/SiO2NPandworkingprincipleoffoamimmunoassayforrapidandquantitativedetectionofE.coliO157:H7免疫夹心泡沫法测定过程见图2.1C和图2.1D。首先，将30μLMIc（10mg·mL-1）与3mLE.coliO157:H7选择性增菌液混合，并在37C温和振荡下孵育30min，然后将复合物用PBST洗涤3次，加入5μLmAb2-Au@Pt/SiO2NP并在37C下再孵育30min。
22同样的，将复合物用PBST洗涤3次并用磁铁分离，然后用50μLPBS重悬后，将夹心复合物转移到96孔板中。将60μL30%H2O2溶液和50μL16mmol·mL-1SDS加入到孔中，迅速用硅胶塞密封，立即插入亚克力细管。在室温下反应25min后，用尺子测量亚克力细管中O2与SDS所形成泡沫的高度，所有数据均通过3次平行测量分析获得。2.2结果和讨论2.2.1免疫夹心泡沫法的原理免疫夹心泡沫法的检测原理如图2.1所示，定量检测只用了96孔板，硅胶塞和亚克力细管。具体装置如图2.1D所示，用硅胶塞密封孔，然后插入亚克力细管。该夹心型泡沫免疫测定法由MIc选择性富集和分离待测菌，并与mAb2-Au@Pt/SiO2NP结合形成夹心免疫结构。Au@PtNP具有将H2O2分解成H2O和O2的优异催化能力，产生的O2被表面活性剂SDS捕获并转化为泡沫，继而通过压力将泡沫推进亚克力细管中，产生肉眼可见并方便测量的高度变化。泡沫的高度与待测目的菌E.coliO157:H7的浓度直接相关，通过测量泡沫的高度来实现定性定量检测目标物的浓度。2.2.2MNP和Au@Pt/SiO2NP的表征图2.2（A）磁珠的透射电镜图；（B）磁珠的红外光谱图Fig.2.2(A)TheTEMimageofMNP;(B)TheFTIRspectraofMNP
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中的大肠杆菌O157:H[J]. 赵远洋,王瑾,林丽萍,郜彦彦,吴国平. 中国食品学报. 2019(03)
[2]乳胶凝集试验快速检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究[J]. 罗玲,罗青平,温国元,王红琳,汪宏才,张腾飞,艾地云,卢琴,张蓉蓉,邵华斌. 中国家禽. 2017(06)
[3]免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157:H7[J]. 顾培科. 大家健康(学术版). 2015(02)
[4]生物传感器检测食源性大肠杆菌O157:H7研究新进展[J]. 刘慧玲,吕敬章,朱智壕,范放,张恒. 食品安全质量检测学报. 2013(06)
[5]食源性致病菌快速检测技术研究进展[J]. 封莉,黄继超,刘欣,黄明,周光宏. 食品科学. 2012(21)
[6]基于甘露糖功能化的水凝胶用于E.coli O157:H7的检测[J]. 周丽霞,何定庚,何晓晓,卿志和,王柯敏,曹杰. 高等学校化学学报. 2012(04)
[7]新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用[J]. 刘道峰,邓省亮,赖卫华. 食品与机械. 2011(06)
[8]一个新的测定Fenton反应产生的·OH及清除的荧光方法[J]. 谷学新,邰超,邹洪,郭启华. 分析科学学报. 2002(06)
[9]水杨基荧光酮荧光法测定钴Ⅱ-过氧化氢体系产生的羟自由基[J]. 任凤莲,吴南,司士辉. 分析化学. 2001(01)
博士论文
[1]快速检测农产品中大肠杆菌O157：H7的生物传感方法与仪器研究[D]. 王一娴.浙江大学 2013
本文编号：3460097
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