PKCα在TOCP抑制SK-N-SH细胞自噬中的作用及机制研究

发布时间：2021-11-17 09:42

　　目的:探讨PKCα在TOCP影响SK-N-SH神经细胞自噬的作用及机制。方法:1.SK-N-SH细胞经TOCP（0¹ mmol/L）染毒,通过MTT法测定该化合物对细胞增殖的影响,并利用SPSS软件算出SK-N-SH细胞暴露于TOCP（48 h）的半数抑制浓度（IC50）,并确定后期实验的染毒剂量。2.SK-N-SH细胞经TOCP（0¹ mmol/L）染毒,通过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、pPKCα蛋白、自噬蛋白（P62、Beclin 1、LC3II/LC3I）、自噬受体蛋白（OPTN、NBR1）、细胞骨架蛋白（p-Tau、NF-H、MAP2）和泛素化蛋白（Ub）表达水平。使用了透射电子显微镜观察自噬体的生成情况。3.SK-N-SH细胞经PKCα激活剂（PMA）和抑制剂（SP）预处理0.5 h后,0.75 mmol/L TOCP染毒48 h,过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、p-PKCα蛋白、自噬蛋白（P62、Beclin 1、LC3II/LC... 

【文章来源】：南华大学湖南省

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

TOCP对SK-N-SH细胞增殖影响

119一方面，在用TOCP（0.75mM）处理的SK-N-SH细胞的细胞质中观察到一些自噬泡，其中包含了大量被自噬降解的细胞器，例如内质网和线粒体。以上结果表明TOCP处理可抑制SK-N-SH细胞内的自噬流。图3.2不同浓度的TOCP处理SK-N-SH细胞后自噬相关蛋白Beclin1、P62和LC3II/I表达水平影响A：SK-N-SH细胞Beclin1、P62和LC3II/IWB结果图；B:Beclin1蛋白灰度值分析；C：P62灰度值分析；D：LC3II/I蛋白灰度值分析；与对照组比较，*:P<0.05，n=3（E）透射电子显微镜图像，描绘了对照和TOCP（0.75mM）处理48小时的SK-N-SH细胞的超微结构。黑色箭头，自噬泡。白色箭头，液泡。比例尺：1μm。

203.3TOCP对SK-N-SH细胞PKCα活性的影响为了研究TOCP和PKCα的相关性，SK-N-SH细胞经TOCP（0~1mmol/L）处理的SK-N-SH细胞，WB检测p-PKCα、PKCα和对照GAPDH的表达（图3.3A）。如图3.3B所示，在经不同浓度TOCP处理的SK-N-SH细胞中，p-PKCα/PKCα呈明显的剂量依赖性增加。随后，我们进一步研究SK-N-SH细胞分别经PKCα激活剂（PMA）和抑制剂（SP）预处理0.5h后，0.75mmol/LTOCP染毒48h，WB检测了p-PKCα，PKCα和对照GAPDH的表达（图3.3C）。对每个条带灰度值分析之后，我们发现相比于对照组，TOCP，PMA和TOCP+PMA组中p-PKCα/PKCα增加，而SP和SP+TOCP组中p-PKCα/PKCα下降（图3.3D）。并使用了免疫荧光法测定PKCα蛋白（见图3.3E）表达水平来进一步验证WB的结果。以上数据表明TOCP能激活人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的PKCα活性。图3.3TOCP对细胞内PKCα活性影响（A）p-PKCα和PKCα蛋白WB结果图；（B）p-PKCα/PKCα蛋白灰度值分析；（C）p-PKCα和PKCα蛋白WB结果图；（D）p-PKCα/PKCα灰度值分析；与阴性对照组比较，*：P<0.05；#：与TOCP组比较P<0.05，n=3。（E）PKCα免疫荧光；

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3500651