产物可直接进行“TA”克隆的高保真PCR法

发布时间：2021-11-17 16:22

　　[目的]介绍一种PCR产物直接进行"TA"克隆的高保真PCR法,减少高保真PCR产物"TA"克隆的中间步骤。[方法]Trizol法提取人肝癌细胞SMMC-7721总RNA,并将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,联合不同特性的Taq DNA聚合酶扩增PKC基因的蛋白编码区。PCR产物经纯化后进行"TA"克隆、细菌转化、筛选培养、质粒抽提、酶切鉴定和测序鉴定等。[结果]高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物未发现DNA突变,但不能直接进行"TA"克隆。Taq DNA聚合酶扩增的产物可直接进行"TA"克隆,但其内部存在多个突变位点,保真性明显不足。联合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶（双酶联用）扩增的PCR产物可直接进行"TA"克隆,且DNA测序未发现突变。[结论]双酶联用PCR可以获得高保真PCR产物,并直接进行"TA"克隆。 

【文章来源】：安徽农业科学. 2020,48(05)

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【部分图文】：

图1 双酶联用PCR扩增靶基因PKCε的蛋白编码区

PCR产物的“TA”克隆

不同来源的单克隆菌落经扩大培养、质粒抽提和Xho Ⅰ酶切鉴定后, 发现T载体中所含有的靶序列长度均一致(图3)。对这些质粒进行DNA测序,测序结果显示用LA Taq? DNA聚合酶扩增的2.2 kb的DNA产物中存在多处点突变和缺失突变,其中一株克隆菌落中的靶DNA有6处点突变;而用PrimeSTAR? G×L DNA聚合酶和双酶联用扩增的PCR产物具有高度保真性,无基因突变。说明双酶联用可以保证PCR扩增产物的高保真性。3 讨论

【参考文献】：
期刊论文
[1]荧光定量PCR技术的原理及其在植物研究中的应用[J]. 黄小玲,张登,廖嘉明,欧阳昆唏.  安徽农业科学. 2018(25)
[2]低温变性下复合PCR技术及其应用[J]. 梁卉,陈国杰,于燕,熊礼宽.  遗传. 2018(03)
[3]山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化[J]. 撒云俐,那冬晨.  安徽农业科学. 2016(33)



本文编号：3501273