NgAgo-gDNA编辑RNA切割位点多样性观察
发布时间：2021-11-18 04:43
目的:CRISPR/Cas9是目前运用最广泛以RNA为引导的基因编辑系统,具有核酸内切酶功能。与其类似的Ago2蛋白在5’磷酸化或羟基化修饰的gDNA引导下也具有核酸内切酶功能。然而Ago蛋白仅在高温发挥作用这一特点限制了其在哺乳动物中的运用。最近有新的报道表明Ago蛋白家族中的NgAgo蛋白在37℃可能降解RNA。本研究旨在探讨NgAgo-gDNA基因编辑技术在体外和细胞实验中的编辑能力,并鉴定其新的切割位点。方法:1.体外切割实验:采用双酶切的方法构建pET-24a（+）-NgAgo原核表达质粒,转化入大肠杆菌菌株中进行表达。通过IPTG诱导pET-24a（+）-NgAgo阳性菌株的表达,并纯化NgAgo蛋白;设计与被切割靶标RNA反向互补并以5’端磷酸化或羟基化修饰的gDNA;用体外转录的方式合成靶标RNA:GFP-RNA、HCV-RNA1和HCV-RNA2;设计切割反应,在体外进行NgAgo-gDNA切割靶标RNA的实验。收集并纯化切割体系中的总RNA,将总RNA逆转录成cDNA后进行PCR,将PCR产物进行测序,验证NgAgo-gDNA的切割位点。2.细胞内切割实验:构建pc...
【文章来源】：南华大学湖南省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
左为空载体pET-24a（+），右为空载体pcDNA3.1（-）
第三章 结果-24a（+）-NgAgo 原核表达载体4a（+）作为原核表达载体，合成 NgAgo 编码序和 NgAgo 编码序列同时进行双酶切，酶切产物NgAgo 原核表达质粒。将原核表达质粒转化后挑 pET-24a（+）-NgAgo 阳性重组质粒。用 EcoR进行双酶切鉴定。双酶切后的产物用琼脂糖凝胶：NgAgo 编码序列长度为 2840bp，在目的位置于 pET-24a（+）-NgAgo 重组质粒大小。结果显粒构建成功。
图 2：NgAgo 蛋白的验证（A）考马斯亮蓝染色。M1为蛋白 Marker、1 为 BSA 蛋白、2 为 NgAgo 蛋白泳道，箭头所指即为 NgAgo 蛋白位置；（B）蛋白质免疫印记实验。M2为蛋白 Marker、3 为 NgAgo 蛋白，箭头所指即为 NgAgo 蛋白位置。3.3 NgAgo-gDNA 对 DNA 无编辑作用3.3.1 NgAgo-gDNA 可减少细胞内 GFP 荧光数将NgAgo、gDNA和GFP共同转染293T细胞。观察GFP表达情况（图3-1.A），与对照组相比，NgAgo 和 5’P-FW-gDNA 共转染 293T 细胞组的 GFP 荧光蛋白表达降低。GFP 荧光细胞计数统计结果分析（图 3-1.B ）显示差异有统计学意义。
本文编号：3502231
【文章来源】：南华大学湖南省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
左为空载体pET-24a（+），右为空载体pcDNA3.1（-）
第三章 结果-24a（+）-NgAgo 原核表达载体4a（+）作为原核表达载体，合成 NgAgo 编码序和 NgAgo 编码序列同时进行双酶切，酶切产物NgAgo 原核表达质粒。将原核表达质粒转化后挑 pET-24a（+）-NgAgo 阳性重组质粒。用 EcoR进行双酶切鉴定。双酶切后的产物用琼脂糖凝胶：NgAgo 编码序列长度为 2840bp，在目的位置于 pET-24a（+）-NgAgo 重组质粒大小。结果显粒构建成功。
图 2：NgAgo 蛋白的验证（A）考马斯亮蓝染色。M1为蛋白 Marker、1 为 BSA 蛋白、2 为 NgAgo 蛋白泳道，箭头所指即为 NgAgo 蛋白位置；（B）蛋白质免疫印记实验。M2为蛋白 Marker、3 为 NgAgo 蛋白，箭头所指即为 NgAgo 蛋白位置。3.3 NgAgo-gDNA 对 DNA 无编辑作用3.3.1 NgAgo-gDNA 可减少细胞内 GFP 荧光数将NgAgo、gDNA和GFP共同转染293T细胞。观察GFP表达情况（图3-1.A），与对照组相比，NgAgo 和 5’P-FW-gDNA 共转染 293T 细胞组的 GFP 荧光蛋白表达降低。GFP 荧光细胞计数统计结果分析（图 3-1.B ）显示差异有统计学意义。
本文编号：3502231
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3502231.html
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