新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究
发布时间：2021-11-23 09:44
腈水合酶（nitrile hydratase,NHase,EC 4. 2. 1. 84）是一种金属酶,能将腈类物质催化水合生成酰胺类物质,在工业上主要应用于烟酰胺和丙烯酰胺的生产。腈水合酶在应用过程中,普遍存在热稳定性较差的缺陷,而腈类的水合催化属于放热反应,在工业催化过程中,过高的反应温度使得腈水合酶的催化效率、重复利用率均较低,故寻找一种耐热型腈水合酶对工业应用以及理论研究具有重要意义。该研究以提高腈水合酶热稳定性为出发点,从美国国立生物技术信息中心通过BLAST筛选到一种新型耐热腈水合酶,该腈水合酶来源为温泉热碱芽孢杆菌（Caldalkalibacillus thermarum TA2. A1）,该菌株最适生长温度为65～70℃。将来源于Cal. thermarum TA2. A1的腈水合酶基因序列进行密码子优化,基因合成后在大肠杆菌BL21（DE3）宿主中异源表达,通过在该腈水合酶β亚基的C端添加strep标签成功纯化该酶,测定其在65℃的半衰期为3 h,在30℃下催化烟腈的比酶活为395 U/mg,其全细胞催化反应速率比已报道数据将近快1倍,烟酰胺的最终产量提高了25%,更有...
【文章来源】：食品与发酵工业. 2020,46(14)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Cal.t NHase基因电泳图
Cal.t NHase SDS-PAGE图
不同的反应温度对Cal.t NHase酶活的影响如图3-a所示，该酶最适温度为37℃，且在35～40℃该蛋白酶活差异不大，在低温下该蛋白酶活较低;不同的p H对Cal.t NHase酶活的影响如图3-b所示，最适p H为7.0且在p H=6.0～7.5其比酶活变化不大。Cal.t NHase的热稳定性如图3-c所示，来源于工业应用菌株红球菌R.rhodochrous J1的腈水合酶(H-NHase)在65℃下处理30 min完全丧失活性，来源于嗜热假诺卡氏菌P.thermophila JCM 3095的腈水合酶(Pt-NHase)在65℃处理1 h残余酶活仅为10%,Cal.t NHase在65℃下处理3 h仍能维持50%的酶活，相较于其他腈水合酶具有较好的热稳定性，对研究腈水合酶热稳定性具有重要参考价值。此外，良好的热稳定性能够节约能耗、降低成本及提高菌体重复利用率，在工业应用中具有重要意义。PEI等研究发现Pt NHase的β亚基第6个螺旋(Q111-G125)对腈水合酶热稳定性影响较大[10],Cal.t NHase、Pt NHase、Pp NHase、L-NHase、H-NHase相对应的β亚基第六螺旋序列对比如图4所示，从序列对比中可以看到此螺旋序列不保守，但热稳定性相对较好的Cal.t NHase、Pt NHase和L-NHase的L115、Q121和G126相对保守，可能是影响热稳定性的关键位点。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化[J]. 张晓欢,崔文璟,周哲敏. 微生物学通报. 2016(10)
[2]利用同源片段交换提高腈水合酶的热稳定性[J]. 房月芹,崔文璟,崔幼恬,陈艳,周哲敏. 中国生物制品学杂志. 2015(03)
[3]Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略[J]. 余越春,崔文璟,刘义,周哲敏. 工业微生物. 2014(02)
硕士论文
[1]重组大肠杆菌产腈水合酶发酵优化及烟酰胺生产工艺的建立[D]. 王哲.江南大学 2017
[2]高分子量腈水合酶的异源表达、全细胞催化及分子改造[D]. 张晓欢.江南大学 2016
本文编号：3513622
【文章来源】：食品与发酵工业. 2020,46(14)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Cal.t NHase基因电泳图
Cal.t NHase SDS-PAGE图
不同的反应温度对Cal.t NHase酶活的影响如图3-a所示，该酶最适温度为37℃，且在35～40℃该蛋白酶活差异不大，在低温下该蛋白酶活较低;不同的p H对Cal.t NHase酶活的影响如图3-b所示，最适p H为7.0且在p H=6.0～7.5其比酶活变化不大。Cal.t NHase的热稳定性如图3-c所示，来源于工业应用菌株红球菌R.rhodochrous J1的腈水合酶(H-NHase)在65℃下处理30 min完全丧失活性，来源于嗜热假诺卡氏菌P.thermophila JCM 3095的腈水合酶(Pt-NHase)在65℃处理1 h残余酶活仅为10%,Cal.t NHase在65℃下处理3 h仍能维持50%的酶活，相较于其他腈水合酶具有较好的热稳定性，对研究腈水合酶热稳定性具有重要参考价值。此外，良好的热稳定性能够节约能耗、降低成本及提高菌体重复利用率，在工业应用中具有重要意义。PEI等研究发现Pt NHase的β亚基第6个螺旋(Q111-G125)对腈水合酶热稳定性影响较大[10],Cal.t NHase、Pt NHase、Pp NHase、L-NHase、H-NHase相对应的β亚基第六螺旋序列对比如图4所示，从序列对比中可以看到此螺旋序列不保守，但热稳定性相对较好的Cal.t NHase、Pt NHase和L-NHase的L115、Q121和G126相对保守，可能是影响热稳定性的关键位点。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化[J]. 张晓欢,崔文璟,周哲敏. 微生物学通报. 2016(10)
[2]利用同源片段交换提高腈水合酶的热稳定性[J]. 房月芹,崔文璟,崔幼恬,陈艳,周哲敏. 中国生物制品学杂志. 2015(03)
[3]Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略[J]. 余越春,崔文璟,刘义,周哲敏. 工业微生物. 2014(02)
硕士论文
[1]重组大肠杆菌产腈水合酶发酵优化及烟酰胺生产工艺的建立[D]. 王哲.江南大学 2017
[2]高分子量腈水合酶的异源表达、全细胞催化及分子改造[D]. 张晓欢.江南大学 2016
本文编号：3513622
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3513622.html
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