菊粉内切酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质测定
发布时间：2021-12-15 21:30
为了实现菊粉内切酶在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高活性表达并对表达的菊粉内切酶酶学性质、水解菊粉的产物进行分析。通过下载无花果曲霉菊粉内切酶基因的编码序列,做了密码子优化后进行全基因合成,然后在毕赤酵母GS115中表达。对表达的菊粉内切酶的酶活、最适反应温度、最适pH值、热稳定性进行了分析,最后对酶水解菊粉的产物进行了高效液相色谱（HPLC）分析。摇瓶表达的酶活力为420 U/mL,酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0。HPLC分析表明:表达的菊粉内切酶酶解底物菊粉的主要产物为低聚果糖,聚合度为3～5之间。构建的工程酵母可以高效表达菊粉内切酶,可以用于生产低聚果糖。
【文章来源】：井冈山大学学报(自然科学版). 2020,41(03)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
序列；b：密码子优化后序列图1RNA二级结构预测Fig.1TheRNAsecondarystructureprediction注：a：原始
为0.05，优化后序列GC含量降低到52%，CAI提高到0.73。RNA二级结构会影响基因的蛋白表达水平，用软件RNAfoldServer预测优化前后的基因序列的二级结构见图1。从图可知，优化后的序列其结构分支减少了，可以推测优化后序列的RNA二级结构较原来序列的结构更优，表达水平也可能更高。注：a：原始序列；b：密码子优化后序列图1RNA二级结构预测Fig.1TheRNAsecondarystructureprediction2.2菊粉内切酶酶活将inu2基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上，测序保证序列正确，见图2。经BglⅡ线性化转化毕赤酵母GS115，抗生素G418筛选高拷贝克拢SDS-PAGE分析表明，菊粉内切酶基因表达的蛋白大小正确（图3）。用DNS法对菊粉内切酶的酶活进行测定，酶活力为420U/mL。2.3酶学性质研究将酶活的最大值设定为100%，在不同的温度下（40、45、50、55、60、65、70℃）测定酶活，作出酶的最适反应温度曲线，如图4所示，酶的最适反应温度为55℃，在50~60℃范围内该酶活性较高；酶的热稳定性，酶在40℃条件下非常稳定，温浴72h酶仍然可以保持60%以上的活性，而50℃下温浴12h后酶就仅剩下60%左右的活性，60℃下温浴12h后酶的活性基本丧失；在不同pH（4.0~9.0）条件下测定酶的活性，将最高酶活设定为100%，作出酶的最适反应pH曲线，如图4所示，该酶的最适反应pH为6.0，在低于pH4.0或高于9.0时则几乎检测不到活性。图2密码子优化后序列测序图Fig.2Sequencingdiagramofcodonoptimizedsequence
井冈山大学学报(自然科学版)37注：M：标准蛋白；1：菊粉内切酶蛋白图3菊粉内切酶蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.3SDS-PAGEofendoinulinaseprotein图4菊粉内切酶的最适反应温度（a）和最适反应pH值(b)Fig.4Optimalreactiontemperatureofendoinulinase(a)andoptimumpH(b)2.4酶水解菊粉产物分析酶水解菊粉产物的HPLC图谱如图5所示。由于只购买到聚合度为3-5的低聚果糖，因此在缺乏标准品的情况下没有对聚合度大于5的糖进行分析。从图5可以看出酶水解菊粉的产物主要是聚合度为3-5的低聚果糖，此外还有少量聚合度大于5的低聚果糖。注：a：标准品HPLC图谱；1：果糖；2：葡萄糖；3：蔗糖；4：蔗果三糖；5：蔗果四糖；6：蔗果五糖；b：菊粉内切酶水解菊粉产物HPLC图谱；1：果糖；2：蔗糖；3：聚合度为3的低聚果糖；4：聚合度为4的低聚果糖；5聚合度为5的低聚果糖；6：聚合度大于5的低聚果糖图5菊粉水解产物HPLC图谱Fig.5HPLCchromatogramofinulinhydrolysate3讨论本研究利用异源基因表达技术对来自曲霉的基因在毕赤酵母中进行了分泌表达，并对菊粉内切酶基因inu2密码子进行了优化，构建了毕赤酵母pPIC9K-inu2/GS115菌株，其表达的酶活力为420U/mL。还对inu2基因在酿酒酵母中的表达进行过研究，但蛋白表达量和酶的活性都比较低，无法应用于生产[15]。这说明菊粉内切酶基因的表达受表达体系的影响较大，在不同体系中表达水平差异很大。外源基因表达效率受到密码子偏好性的影响，不同物种密码子偏好性不同，无花果曲霉与酵母就存在很大的差异，这种偏好性实质反应的是物种间不同转运tRNA含量的差异。如果基因含有稀有密码子，而相应的tRNA含量不足，就会导致基因表
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因密码子优化[J]. 贾雪琦,左永春. 生物信息学. 2018(01)
[2]斑马鱼GAPDH蛋白片段的原核表达差异分析[J]. 廖思宁,李松,褚开淼,曾菲,张彪,胡有生. 井冈山大学学报(自然科学版). 2018(01)
[3]低聚果糖的研究进展[J]. 曹敏,雷光鸿,米运宏,王元春,黄忠华,蓝伯广,梁智. 轻工科技. 2017(03)
[4]外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略[J]. 孙玮遥,王向东,林剑. 中国酿造. 2016(09)
[5]毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展[J]. 武婕,张晓雪,余河水,李薇,贾宇平,郭江玉,张丽娟,宋新波. 中国生物工程杂志. 2016(01)
[6]毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 马银鹏,王玉文,党阿丽,孔祥辉,张介驰. 黑龙江科学. 2013(09)
[7]毕赤酵母高效表达策略概述[J]. 陆永超,蒋琳. 微生物学免疫学进展. 2013(01)
[8]内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的高水平表达研究[J]. 冯碧薇,张赓,李悦,袁汉英,吕红. 复旦学报(自然科学版). 2012(01)
[9]DNS法测定菊芋中还原糖含量的研究[J]. 仝瑛,倪士峰,刘建利,赵桂仿,蔺小平. 陕西中医. 2009(11)
[10]毕赤酵母表达系统外源基因表达序列优化的软件设计[J]. 黄义德,杨林骥,张彦定. 生物技术通报. 2007(05)
硕士论文
[1]菊粉酶的筛选、异源表达及固定化[D]. 陈敏.华东理工大学 2014
本文编号：3537174
【文章来源】：井冈山大学学报(自然科学版). 2020,41(03)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
序列；b：密码子优化后序列图1RNA二级结构预测Fig.1TheRNAsecondarystructureprediction注：a：原始
为0.05，优化后序列GC含量降低到52%，CAI提高到0.73。RNA二级结构会影响基因的蛋白表达水平，用软件RNAfoldServer预测优化前后的基因序列的二级结构见图1。从图可知，优化后的序列其结构分支减少了，可以推测优化后序列的RNA二级结构较原来序列的结构更优，表达水平也可能更高。注：a：原始序列；b：密码子优化后序列图1RNA二级结构预测Fig.1TheRNAsecondarystructureprediction2.2菊粉内切酶酶活将inu2基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上，测序保证序列正确，见图2。经BglⅡ线性化转化毕赤酵母GS115，抗生素G418筛选高拷贝克拢SDS-PAGE分析表明，菊粉内切酶基因表达的蛋白大小正确（图3）。用DNS法对菊粉内切酶的酶活进行测定，酶活力为420U/mL。2.3酶学性质研究将酶活的最大值设定为100%，在不同的温度下（40、45、50、55、60、65、70℃）测定酶活，作出酶的最适反应温度曲线，如图4所示，酶的最适反应温度为55℃，在50~60℃范围内该酶活性较高；酶的热稳定性，酶在40℃条件下非常稳定，温浴72h酶仍然可以保持60%以上的活性，而50℃下温浴12h后酶就仅剩下60%左右的活性，60℃下温浴12h后酶的活性基本丧失；在不同pH（4.0~9.0）条件下测定酶的活性，将最高酶活设定为100%，作出酶的最适反应pH曲线，如图4所示，该酶的最适反应pH为6.0，在低于pH4.0或高于9.0时则几乎检测不到活性。图2密码子优化后序列测序图Fig.2Sequencingdiagramofcodonoptimizedsequence
井冈山大学学报(自然科学版)37注：M：标准蛋白；1：菊粉内切酶蛋白图3菊粉内切酶蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.3SDS-PAGEofendoinulinaseprotein图4菊粉内切酶的最适反应温度（a）和最适反应pH值(b)Fig.4Optimalreactiontemperatureofendoinulinase(a)andoptimumpH(b)2.4酶水解菊粉产物分析酶水解菊粉产物的HPLC图谱如图5所示。由于只购买到聚合度为3-5的低聚果糖，因此在缺乏标准品的情况下没有对聚合度大于5的糖进行分析。从图5可以看出酶水解菊粉的产物主要是聚合度为3-5的低聚果糖，此外还有少量聚合度大于5的低聚果糖。注：a：标准品HPLC图谱；1：果糖；2：葡萄糖；3：蔗糖；4：蔗果三糖；5：蔗果四糖；6：蔗果五糖；b：菊粉内切酶水解菊粉产物HPLC图谱；1：果糖；2：蔗糖；3：聚合度为3的低聚果糖；4：聚合度为4的低聚果糖；5聚合度为5的低聚果糖；6：聚合度大于5的低聚果糖图5菊粉水解产物HPLC图谱Fig.5HPLCchromatogramofinulinhydrolysate3讨论本研究利用异源基因表达技术对来自曲霉的基因在毕赤酵母中进行了分泌表达，并对菊粉内切酶基因inu2密码子进行了优化，构建了毕赤酵母pPIC9K-inu2/GS115菌株，其表达的酶活力为420U/mL。还对inu2基因在酿酒酵母中的表达进行过研究，但蛋白表达量和酶的活性都比较低，无法应用于生产[15]。这说明菊粉内切酶基因的表达受表达体系的影响较大，在不同体系中表达水平差异很大。外源基因表达效率受到密码子偏好性的影响，不同物种密码子偏好性不同，无花果曲霉与酵母就存在很大的差异，这种偏好性实质反应的是物种间不同转运tRNA含量的差异。如果基因含有稀有密码子，而相应的tRNA含量不足，就会导致基因表
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因密码子优化[J]. 贾雪琦,左永春. 生物信息学. 2018(01)
[2]斑马鱼GAPDH蛋白片段的原核表达差异分析[J]. 廖思宁,李松,褚开淼,曾菲,张彪,胡有生. 井冈山大学学报(自然科学版). 2018(01)
[3]低聚果糖的研究进展[J]. 曹敏,雷光鸿,米运宏,王元春,黄忠华,蓝伯广,梁智. 轻工科技. 2017(03)
[4]外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略[J]. 孙玮遥,王向东,林剑. 中国酿造. 2016(09)
[5]毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展[J]. 武婕,张晓雪,余河水,李薇,贾宇平,郭江玉,张丽娟,宋新波. 中国生物工程杂志. 2016(01)
[6]毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 马银鹏,王玉文,党阿丽,孔祥辉,张介驰. 黑龙江科学. 2013(09)
[7]毕赤酵母高效表达策略概述[J]. 陆永超,蒋琳. 微生物学免疫学进展. 2013(01)
[8]内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的高水平表达研究[J]. 冯碧薇,张赓,李悦,袁汉英,吕红. 复旦学报(自然科学版). 2012(01)
[9]DNS法测定菊芋中还原糖含量的研究[J]. 仝瑛,倪士峰,刘建利,赵桂仿,蔺小平. 陕西中医. 2009(11)
[10]毕赤酵母表达系统外源基因表达序列优化的软件设计[J]. 黄义德,杨林骥,张彦定. 生物技术通报. 2007(05)
硕士论文
[1]菊粉酶的筛选、异源表达及固定化[D]. 陈敏.华东理工大学 2014
本文编号：3537174
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3537174.html
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