GH43家族β-D-木糖苷酶RuXyn1在马克斯克鲁维酵母中的表达及其应用
发布时间：2022-01-26 17:29
木聚糖的降解需要内切β-木聚糖酶和β-D-木糖苷酶的协同作用,β-D-木糖苷酶能将β-木聚糖酶的水解产物木寡糖降解为木糖,因此在半纤维素的利用中具有重要的意义.本研究将中国牦牛瘤胃微生物来源的糖基水解酶GH43家族β-D-木糖苷酶基因RuXyn1克隆到含两种不同分泌信号肽（菊粉酶信号肽和α-factor信号肽）的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）分泌表达载体（pUKDN132和pUKDN129）中,转化K.marxianus Fim-1 ura3Δ,通过筛选获得两株分泌表达β-D-木糖苷酶基因RuXyn1的重组菌株Fim-1/pUKDN132-RuXyn1和Fim-1/pUKDN129-RuXyn1.重组菌株摇瓶培养72h后,上清液中β-D-木糖苷酶酶活分别为0.304U/mL和0.045U/mL.在5L发酵罐高密度发酵中,Fim-1/pUKDN132-RuXyn1分泌表达的β-D-木糖苷酶酶活为1.75U/mL,而Fim-1/pUKDN129-RuXyn1的酶活为1.6U/mL,表明在表达β-D-木糖苷酶RuXyn1时,菊粉酶信号肽介导的分泌效率优于α...
【文章来源】：复旦学报(自然科学版). 2020,59(05)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
保留型与反转型β-木糖苷酶的催化反应
图4 K.marxianus重组菌株高密度发酵上清的SDS-PAGE检测此外，我们还检测了降解反应过程中的葡萄糖释放量，发现三酶混合组水解96h生成的葡萄糖量为63.65g/L，较二酶混合组和CTec2组分别提高了6.1%和13.7%(P<0.01）（图5(c））．图5(d）为水解96h各组样品上清的HPLC检测结果，可以发现三酶混合组在保留时间7.5min处的产木糖峰和11min处的产葡萄糖峰（图5(d））高于二酶混合组和纤维素酶CTec2组．上述结果表明玉米芯酶解时，在β-木聚糖酶和纤维素酶CTec2中加入β-木糖苷酶RuXyn1能更显著提高玉米芯的降解效率，释放更多的葡萄糖和木糖．由于底物玉米芯中，半纤维素和纤维素紧密粘合并起着固定纤维素的作用[21]，β-木糖苷酶RuXyn1的加入促进了玉米芯中半纤维素的降解，释放木糖，同时纤维素与酶的接触反应面积也随之增加，在CTec2纤维素酶的水解作用下，水解纤维素产生了更多的葡萄糖．
为了检测经重组表达的木糖苷酶RuXyn1对玉米芯的水解能力，我们以2%稀酸预处理玉米芯为底物，测试了β-木糖苷酶RuXyn1与β-木聚糖酶、纤维素酶Cellic CTec2酶的组合降解玉米芯的效果．水解上清液中还原糖的DNS法检测结果发现，在β-木聚糖酶与纤维素酶CTec2中添加1U的β-木糖苷酶RuXyn1后，水解96h后产生的总还原糖量较β-木聚糖酶、纤维素酶CTec2组合酶和纤维素酶CTec2组分别提高了7%(P<0.05）和29.4%(P<0.01）（图5(a））．表明β-木糖苷酶RuXyn1的加入显著提高了玉米芯底物的水解效率．各组样品上清液的HPLC检测结果发现，β-木糖苷酶RuXyn1、β-木聚糖酶与纤维素酶CTec2混合组水解96h生成的木糖量为9.13g/L，比β-木聚糖酶和纤维素酶CTec2或纤维素酶CTec2单酶水解分别提高了12.4%(P<0.05）和23.4%(P<0.01）（图5(b））．其中，由于纤维素酶Cellic CTec2酶为复合酶，包含少量β-D-木糖苷酶（0.33IU/mg)[20]，故其单独水解玉米芯的产物中也包含木糖．图5 β-木糖苷酶RuXyn1提高稀酸处理玉米芯的酶法糖化效率
【参考文献】：
期刊论文
[1]高浓玉米秸秆碱法预处理及半同步糖化发酵生产乙醇的工艺研究[J]. 连战,吕志飞,刘彬,刘欣,李乔丹,田冰,庄倩倩,刘同军. 食品与发酵工业. 2018(10)
[2]信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响[J]. 吴玥,周峻岗,吕红. 复旦学报(自然科学版). 2017(04)
[3]微生物产β-木糖苷酶的研究进展[J]. 范园园,李秀婷,滕超. 食品研究与开发. 2013(12)
[4]秸杆中半纤维素的结构及分离新方法综述[J]. 许凤,钟新春,孙润仓,詹怀宇. 林产化学与工业. 2005(S1)
[5]信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响[J]. 熊爱生,彭日荷,李贤,范惠琴,姚泉洪,郭美锦,张嗣良. 生物化学与生物物理学报. 2003(02)
本文编号：3610889
【文章来源】：复旦学报(自然科学版). 2020,59(05)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
保留型与反转型β-木糖苷酶的催化反应
图4 K.marxianus重组菌株高密度发酵上清的SDS-PAGE检测此外，我们还检测了降解反应过程中的葡萄糖释放量，发现三酶混合组水解96h生成的葡萄糖量为63.65g/L，较二酶混合组和CTec2组分别提高了6.1%和13.7%(P<0.01）（图5(c））．图5(d）为水解96h各组样品上清的HPLC检测结果，可以发现三酶混合组在保留时间7.5min处的产木糖峰和11min处的产葡萄糖峰（图5(d））高于二酶混合组和纤维素酶CTec2组．上述结果表明玉米芯酶解时，在β-木聚糖酶和纤维素酶CTec2中加入β-木糖苷酶RuXyn1能更显著提高玉米芯的降解效率，释放更多的葡萄糖和木糖．由于底物玉米芯中，半纤维素和纤维素紧密粘合并起着固定纤维素的作用[21]，β-木糖苷酶RuXyn1的加入促进了玉米芯中半纤维素的降解，释放木糖，同时纤维素与酶的接触反应面积也随之增加，在CTec2纤维素酶的水解作用下，水解纤维素产生了更多的葡萄糖．
为了检测经重组表达的木糖苷酶RuXyn1对玉米芯的水解能力，我们以2%稀酸预处理玉米芯为底物，测试了β-木糖苷酶RuXyn1与β-木聚糖酶、纤维素酶Cellic CTec2酶的组合降解玉米芯的效果．水解上清液中还原糖的DNS法检测结果发现，在β-木聚糖酶与纤维素酶CTec2中添加1U的β-木糖苷酶RuXyn1后，水解96h后产生的总还原糖量较β-木聚糖酶、纤维素酶CTec2组合酶和纤维素酶CTec2组分别提高了7%(P<0.05）和29.4%(P<0.01）（图5(a））．表明β-木糖苷酶RuXyn1的加入显著提高了玉米芯底物的水解效率．各组样品上清液的HPLC检测结果发现，β-木糖苷酶RuXyn1、β-木聚糖酶与纤维素酶CTec2混合组水解96h生成的木糖量为9.13g/L，比β-木聚糖酶和纤维素酶CTec2或纤维素酶CTec2单酶水解分别提高了12.4%(P<0.05）和23.4%(P<0.01）（图5(b））．其中，由于纤维素酶Cellic CTec2酶为复合酶，包含少量β-D-木糖苷酶（0.33IU/mg)[20]，故其单独水解玉米芯的产物中也包含木糖．图5 β-木糖苷酶RuXyn1提高稀酸处理玉米芯的酶法糖化效率
【参考文献】：
期刊论文
[1]高浓玉米秸秆碱法预处理及半同步糖化发酵生产乙醇的工艺研究[J]. 连战,吕志飞,刘彬,刘欣,李乔丹,田冰,庄倩倩,刘同军. 食品与发酵工业. 2018(10)
[2]信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响[J]. 吴玥,周峻岗,吕红. 复旦学报(自然科学版). 2017(04)
[3]微生物产β-木糖苷酶的研究进展[J]. 范园园,李秀婷,滕超. 食品研究与开发. 2013(12)
[4]秸杆中半纤维素的结构及分离新方法综述[J]. 许凤,钟新春,孙润仓,詹怀宇. 林产化学与工业. 2005(S1)
[5]信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响[J]. 熊爱生,彭日荷,李贤,范惠琴,姚泉洪,郭美锦,张嗣良. 生物化学与生物物理学报. 2003(02)
本文编号：3610889
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