构建反转录病毒小向导RNA表达载体用于小鼠T细胞基因功能研究

发布时间：2022-02-12 09:31

　　目的·构建反转录病毒小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA） 的反转录病毒载体（MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP）经过Xho1和Sal1双酶切后,回收得到反转录病毒载体骨架。以慢病毒sgRNA表达载体为模版,通过PCR扩增获得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重组将U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段组装进反转录病毒载体骨架。为了验证系统的有效性,设计靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并进行克隆。分离Cas9转基因小鼠CD4 T细胞分别进行sgRNA反转录病毒感染,诱导其向Th17细胞分化。细胞因子染色,流式检测Il17a阳性细胞比例。2组独立样本数据比较采用非配对t检验。结果·①成功构建反转录病毒sgRNA载体。②利用反转录病毒载体向小鼠CD4 T细胞递送sgRNA并实现Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA阳性群体中,Il17a阳性群体比率显著降低（P<... 

【文章来源】：上海交通大学学报(医学版). 2020,40(12)北大核心CSCD

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【部分图文】：

反转录病毒sgRNA表达载体构建策略

反转录病毒包装和NIH3T3细胞感染

为了将CRISPR/Cas9系统应用于小鼠Th17细胞分化研究,实验首先建立了Th17细胞体外诱导分化系统。利用小鼠CD4 T细胞分选试剂盒分离Cas9转基因小鼠初始CD4 T 细胞,流式细胞仪检测结果表明细胞纯度在95% 以上(图3)。CD4 T细胞铺孔,观察发现最先分离得到的小鼠CD4 T细胞体积较小,呈圆形。经过3 d体外诱导培养后,细胞数目明显变多,形态逐渐变成椭圆形或者条形。结果说明,实验成功分离小鼠CD4 T细胞并可以进行体外培养,可进行后续实验。2.4 小鼠Th17 细胞中基因敲除


本文编号：3621475