部分激动剂或完全激动剂调节β 2 肾上腺素受体脱敏的结构基础
发布时间：2022-02-16 17:18
G蛋白偶联受体（GPCRs）响应细胞外刺激从而调节多种生理功能。重复或连续的激动剂刺激会导致G蛋白异源三聚体介导的cAMP信号传导迅速返回基础水平,这是GPCR脱敏的一个非常保守的过程。该反应涉及受体磷酸化,GPCR和G蛋白的解偶联以及β-arrestin的结合与受体内吞。先前的研究报道了部分激动剂引起的GPCR脱敏作用少于完全激动剂。值得注意的是,GPCR的脱敏反应在调节受体激活以及GPCR靶标药物设计中起着至关重要的作用。然而,由部分或完全激动剂诱导的GPCR脱敏在结构方面的信息仍然十分匮乏。β2-肾上腺素能受体（β2AR）是一种典型的ClassA家族的GPCR。大量研究显示部分激动剂引起β2AR脱敏降低的原因是β2AR的第三细胞内环（ICL3）和羧基末端尾部（C-tail）磷酸化减少。最近发现部分激动剂沙丁胺醇引起(β2AR磷酸化的初始速率要比完全激动剂（例如肾上腺素和异丙肾上腺素）慢,并且显著降低受体的脱敏性,表明部分和完全激动剂可能诱导了 GPCR的独特激活构象。本文的第一部分我们通过亲和纯化技术分别得到了β2肾上腺素受体和G蛋白异源三聚体,并在加入部分或完全激动剂的条件下将...
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省211工程院校985工程院校
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 部分激动剂沙丁胺酵或完全激动剂异丙肾上腺素调节β_2肾上腺素受体脱敏的结构基础
第1章 文献背景综述
1.1 G蛋白偶联受体
1.1.1 G蛋白偶联受体概述
1.1.2 G蛋白偶联受体的分类特征
1.1.3 GPCR的药理学意义
1.2 G蛋白
1.3 β_2肾上腺素受体
1.3.1 分类与组织分布
1.3.2 β_2AR介导的信号通路
1.3.3 β_2AR的多种小分子激动剂
1.3.4 β_2AR的结构信息
1.4 β_2肾上腺素受体的脱敏机制
1.4.1 GPCR的脱敏信号通路
1.4.2 完全激动剂与部分激动剂对受体脱敏的影响
1.5 单颗粒冷冻电镜技术
1.5.1 单颗粒冷冻电镜技术的发展
1.5.2 冷冻电子显微技术的一般流程
1.5.3 单颗粒三维重构原理
1.5.4 分辨率的革命
1.5.5 冷冻电镜在GPCR结构解析中的应用
1.6 本课题的研究意义
第2章 实验材料与方法
2.1 载体和蛋白基因、克隆表达菌株
2.2 主要实验仪器
2.3 主要溶液配方
2.4 β_2肾上腺素受体的细胞表达
2.4.1 β_2AR重组质粒的转化
2.4.2 重组Bacmid DNA的分离提取
2.4.3 Bacmid转染
2.4.4 扩病毒
2.4.5 β_2AR Sf9细胞的大量表达
2.5 β_2肾上腺素受体-G蛋白三聚体复合物的纯化与组装
2.5.1 β_2肾上腺素受体的纯化
2.5.2 Gs蛋白的表达与纯化
2.5.3 抗体Nb35的表达与纯化
2.5.4 β_2AR-Gs复合物的组装
2.6 电镜样品的制备与观察
2.6.1 负染样品的制备
2.6.2 负染样品的电镜观察
2.6.3 冷冻样品的制备
2.6.4 负染样品的电镜观察
2.6.5 300kV Titan krios电镜冷冻数据收集
2.7 冷冻电镜数据的处理
2.8 模型搭建与优化
第3章 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物的电镜结构
3.1 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物的克隆及表达纯化
3.2 负染样品的制备与观察
3.3 冷冻样品的制备与优化
3.4 200kV电镜冷冻数据的小量收集
3.5 300kV电镜冷冻数据的收集与处理
3.6 模型搭建
3.6.1 模型搭建概况
3.6.2 模型搭建的评估
3.7 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物的结构分析
3.7.1 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物结构概况
3.7.2 沙丁胺醇结合口袋的结构分析
3.7.3 与沙美特罗结合方式的比较
3.7.4 α-helical结构域的构象变化
3.8 本章小结
第4章 异丙肾上腺素与β_2AR-Gs复合物的电镜结构
4.1 异丙肾上腺素与β_2AR-Gs复合物的表达纯化
4.2 样品状态的初步筛查
4.3 冷冻数据的收集与结构计算
4.4 模型搭建
4.5 完全激动剂和部分激动剂的结合对受体脱敏的影响
4.5.1 结构口袋的构象变化
4.5.2 受体的构象变化
4.5.3 细胞内环的构象变化
4.6 本章小结
第二部分 植物钾离子通道KAT1内向整流的结构基础
第5章 背景综述与方法
5.1 植物中的钾离子通道
5.1.1 钾离子对植物的重要作用
5.1.2 植物中钾离子通道的分类与特征
5.2 保卫细胞中的钾离子通道种群
5.3 内向整流K~+通道KAT1概况
5.4 辅助亚基KAB1的作用
5.5 植物钾离子通道的结构信息
5.6 超极化激活钾离子通道的机制
5.7 实验材料与方法
5.7.1 KAT1的克隆、表达与纯化
5.7.2 KAT1冷冻制样与数据收集
5.7.3 CHO细胞质粒构建、细胞培养及瞬时转染
5.7.4 CHO细胞的电生理分析
第6章 KAT1的冷冻电镜结构解析
6.1 KAT1-KAB1的表达与纯化
6.2 电镜观察与制样条件摸索
6.2.1 KAT1-KAB1样品的初步电镜观察
6.2.2 辅助亚基KAB1的影响
6.2.3 去垢剂类型和去垢剂浓度的影响
6.2.4 初步二维分类
6.3 KAT1冷冻数据的大量收集与计算
6.4 模型搭建
6.5 KAT1的结构概况
6.6 本章小结
第7章 总结与展望
参考文献
附录
致谢
在读期间已发表或尚未发表的研究成果
本文编号：3628349
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省211工程院校985工程院校
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 部分激动剂沙丁胺酵或完全激动剂异丙肾上腺素调节β_2肾上腺素受体脱敏的结构基础
第1章 文献背景综述
1.1 G蛋白偶联受体
1.1.1 G蛋白偶联受体概述
1.1.2 G蛋白偶联受体的分类特征
1.1.3 GPCR的药理学意义
1.2 G蛋白
1.3 β_2肾上腺素受体
1.3.1 分类与组织分布
1.3.2 β_2AR介导的信号通路
1.3.3 β_2AR的多种小分子激动剂
1.3.4 β_2AR的结构信息
1.4 β_2肾上腺素受体的脱敏机制
1.4.1 GPCR的脱敏信号通路
1.4.2 完全激动剂与部分激动剂对受体脱敏的影响
1.5 单颗粒冷冻电镜技术
1.5.1 单颗粒冷冻电镜技术的发展
1.5.2 冷冻电子显微技术的一般流程
1.5.3 单颗粒三维重构原理
1.5.4 分辨率的革命
1.5.5 冷冻电镜在GPCR结构解析中的应用
1.6 本课题的研究意义
第2章 实验材料与方法
2.1 载体和蛋白基因、克隆表达菌株
2.2 主要实验仪器
2.3 主要溶液配方
2.4 β_2肾上腺素受体的细胞表达
2.4.1 β_2AR重组质粒的转化
2.4.2 重组Bacmid DNA的分离提取
2.4.3 Bacmid转染
2.4.4 扩病毒
2.4.5 β_2AR Sf9细胞的大量表达
2.5 β_2肾上腺素受体-G蛋白三聚体复合物的纯化与组装
2.5.1 β_2肾上腺素受体的纯化
2.5.2 Gs蛋白的表达与纯化
2.5.3 抗体Nb35的表达与纯化
2.5.4 β_2AR-Gs复合物的组装
2.6 电镜样品的制备与观察
2.6.1 负染样品的制备
2.6.2 负染样品的电镜观察
2.6.3 冷冻样品的制备
2.6.4 负染样品的电镜观察
2.6.5 300kV Titan krios电镜冷冻数据收集
2.7 冷冻电镜数据的处理
2.8 模型搭建与优化
第3章 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物的电镜结构
3.1 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物的克隆及表达纯化
3.2 负染样品的制备与观察
3.3 冷冻样品的制备与优化
3.4 200kV电镜冷冻数据的小量收集
3.5 300kV电镜冷冻数据的收集与处理
3.6 模型搭建
3.6.1 模型搭建概况
3.6.2 模型搭建的评估
3.7 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物的结构分析
3.7.1 沙丁胺醇与β_2AR-Gs复合物结构概况
3.7.2 沙丁胺醇结合口袋的结构分析
3.7.3 与沙美特罗结合方式的比较
3.7.4 α-helical结构域的构象变化
3.8 本章小结
第4章 异丙肾上腺素与β_2AR-Gs复合物的电镜结构
4.1 异丙肾上腺素与β_2AR-Gs复合物的表达纯化
4.2 样品状态的初步筛查
4.3 冷冻数据的收集与结构计算
4.4 模型搭建
4.5 完全激动剂和部分激动剂的结合对受体脱敏的影响
4.5.1 结构口袋的构象变化
4.5.2 受体的构象变化
4.5.3 细胞内环的构象变化
4.6 本章小结
第二部分 植物钾离子通道KAT1内向整流的结构基础
第5章 背景综述与方法
5.1 植物中的钾离子通道
5.1.1 钾离子对植物的重要作用
5.1.2 植物中钾离子通道的分类与特征
5.2 保卫细胞中的钾离子通道种群
5.3 内向整流K~+通道KAT1概况
5.4 辅助亚基KAB1的作用
5.5 植物钾离子通道的结构信息
5.6 超极化激活钾离子通道的机制
5.7 实验材料与方法
5.7.1 KAT1的克隆、表达与纯化
5.7.2 KAT1冷冻制样与数据收集
5.7.3 CHO细胞质粒构建、细胞培养及瞬时转染
5.7.4 CHO细胞的电生理分析
第6章 KAT1的冷冻电镜结构解析
6.1 KAT1-KAB1的表达与纯化
6.2 电镜观察与制样条件摸索
6.2.1 KAT1-KAB1样品的初步电镜观察
6.2.2 辅助亚基KAB1的影响
6.2.3 去垢剂类型和去垢剂浓度的影响
6.2.4 初步二维分类
6.3 KAT1冷冻数据的大量收集与计算
6.4 模型搭建
6.5 KAT1的结构概况
6.6 本章小结
第7章 总结与展望
参考文献
附录
致谢
在读期间已发表或尚未发表的研究成果
本文编号：3628349
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3628349.html
教材专著
