固氮施氏假单胞菌调控蛋白NifA和GlnK与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作研究

发布时间：2022-07-08 15:36

　　生物固氮是高耗能的过程,每还原1分子N2消耗16分子ATP,因此,固氮基因的表达受到胞内严谨的调控,能量合成是影响固氮基因表达的重要因素。中心碳代谢是生物体所需能量的主要来源,α-酮戊二酸是胞内碳状态的信号分子。研究表明,微生物中氮代谢调控蛋白GlnK可通过与α-酮戊二酸结合从而感知体内碳信号并调控氮代谢基因的表达,通过直接分子对话介导碳氮代谢偶联调控。此外,研究发现某些固氮菌中,固氮特异调节蛋白NifA也具有感知并结合α-酮戊二酸的能力,表明固氮基因的表达可直接响应胞内碳信号水平。施氏假单胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）是一株水稻根际联合固氮菌,该菌在低氮、微好氧条件具有固氮能力,该菌的固氮基因表达调控机制研究比较深入,但氮代谢调控系统对碳信号的感应传递模式及调控机制仍不清楚。本研究分析了 A1501菌中氮代谢调控蛋白GlnK和NifA的蛋白序列特征,并通过同源建模、位点突变、蛋白表达及蛋白-小分子互作等方法,测定了 A1501菌中GlnK和NifA蛋白与α-酮戊二酸的分子互作,比较了 NifA蛋白与突变蛋白对固氮基因表达的影响,研究结果为深入解... 

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 生物固氮
        1.1.1 生物固氮概述
        1.1.2 影响生物固氮活性的环境因素
    1.2 固氮基因表达调控机制
        1.2.1 棕色固氮菌固氮基因表达网络与机制
        1.2.2 肺炎克雷伯固氮基因表达网络与机制
        1.2.3 施氏假单胞菌A1501固氮基因表达网络与机制
    1.3 固氮调控蛋白GlnK与NifA的研究进展
        1.3.1 一般氮代谢调控PII蛋白的研究进展
        1.3.2 固氮特异正调控蛋白NifA的研究进展
    1.4 立题依据与技术路线
        1.4.1 立题依据
        1.4.2 技术路线
第二章 GlnK蛋白与α-酮戊二酸的体外互作
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和载体
        2.1.2 培养基及缓冲液
        2.1.3 主要酶类和试剂盒
        2.1.4 主要仪器
    2.2 方法
        2.2.1 细菌基因组的提取
        2.2.2 PCR扩增
        2.2.3 蛋白表达载体的构建
        2.2.4 蛋白诱导表达及纯化
        2.2.5 微量热泳动(Microscale Thermophoresis,MST)实验
    2.3 实验结果
        2.3.1 GlnK生物信息学分析
        2.3.2 GlnK及其点突变蛋白表达载体的构建
        2.3.3 GlnK及其点突变蛋白的诱导表达及纯化
        2.3.4 GlnK及其点突变蛋白与小分子物质α-酮戊二酸的互作
        2.3.5 GlnK与小分子物质α-酮戊二酸互作的空间结构模拟
    2.4 讨论
第三章 NifA蛋白与α-酮戊二酸的体外结合
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 培养基及缓冲液
        3.1.3 主要酶和试剂盒
        3.1.4 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 PCR扩增
        3.2.2 提取低拷贝质粒pLAFR3
        3.2.3 三亲结合
        3.2.4 固氮酶活测定
        3.2.5 菌株RNA的提取
        3.2.6 反转录
        3.2.7 实时荧光定量(qRT-PCR)
        3.2.8 Western Blot
        3.2.9 生长曲线测定
        3.2.10 过氧化氢冲击
        3.2.11 盐冲击
        3.2.12 山梨醇冲击
        3.2.13 Swimming实验
        3.2.14 生物膜测定
    3.3 实验结果
        3.3.1 NifA蛋白生物信息学分析
        3.3.2 NifA及NifA-F119S蛋白表达载体的构建
        3.3.3 NifA及NifA-F119S蛋白的诱导表达及纯化
        3.3.4 NifA及NifA-F119S蛋白与小分子物质α-酮戊二酸的互作
        3.3.5 NifA与小分子物质α-酮戊二酸互作的空间结构模拟
        3.3.6 野生型nifA基因及突变nifA基因回补nifA突变株的回补株构建
        3.3.7 与nifA突变株相关菌株固氮酶活测定
        3.3.8 固氮条件下野生型及nifA突变株和功能回补株中nifA和nifH基因的表达
        3.3.9 Western Blot检测不同菌株NifH蛋白表达量
        3.3.10 nifA基因全局调控功能的鉴定
    3.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3657290