用于微管动力学定量分析的荧光探针
发布时间：2022-10-04 16:10
微管是真核生物的主要细胞骨架成分之一,在很多细胞生物活动中起着重要的作用。微管是一个动态的结构,其动态性对细胞分裂、细胞迁移、细胞极性等生命活动至关重要。实时监测微管的动态行为有助于理解微管的调控机制和微管相关的细胞活动过程。但是,关于微管动态性调控的具体分子机制,尤其是微管蛋白亚型和微管蛋白翻译后修饰组成的微管密码对微管动态性的调控机制,仍不甚清楚。基于全内反射荧光显微成像的微管体外重构是精细地研究微管自身动态和微管相关蛋白对微管动态性调控的重要手段。该技术手段需要在微管蛋白上偶联荧光基团,但是,这一过程步骤繁琐且导致大部分微管蛋白丧失了微管聚合活性。因此,如何从有限样本中获得单一亚型或特定翻译后修饰的荧光标记微管蛋白是微管领域内的一大瓶颈,从而限制了利用该技术手段对微管蛋白密码的深入研究。目前基于微管药物的小分子化合物探针对微管动态性有显著影响,限制了其在基于全内反射显微成像的微管体外重构系统中的应用。为了避免对微管动态性的干扰,我们选择亲和力适中的小肽片段作为微管探针的识别单元。本论文开发的小肽荧光探针能特异性标记微管,可以取代微管蛋白偶联荧光基团的方法用于体外微管重构分析,这使...
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 前言
1.1 微管的结构和功能
1.1.1 微管的组成和结构
1.1.2 微管的功能体现
1.2 微管的动态不稳定性
1.2.1 动态是微管的显著特征
1.2.2 微管动态的结构基础
1.2.3 微管动态调控
1.2.4 马达蛋白Kinesin-1
1.3 微管的成像方法
1.3.1 体外重构微管的成像方法
1.3.2 细胞内微管的成像方法
1.4 研究目的和研究内容
1.4.1 研究目的
1.4.2 研究内容
第2章 实验材料与方法
2.1 实验试剂与材料
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 噬菌体筛选多肽
2.3.2 制纯化微管蛋白亲和柱
2.3.3 纯化微管蛋白
2.3.4 微管蛋白的荧光标记
2.3.5 微管相关蛋白的纯化
2.3.6 微管共沉降实验
2.3.7 探针标记微管的相关实验
2.3.8 基因干扰实验
2.3.9 免疫印迹实验
2.3.10 免疫荧光实验
2.3.11 体外探针孵育活细胞实验
2.3.12 小肽质粒转染实验
2.3.13 定量分析方法
第3章 实验结果
3.1 探针设计与合成
3.1.1 微管探针的设计
3.1.2 探针识别单元的淘选
3.1.3 探针的合成
3.2 成功搭建基于全内反射荧光显微镜的体外微管研究技术体系
3.3 探针标记体外重构的微管
3.3.1 合成的初步探针不能标记微管
3.3.2 改造后的探针可以标记微管
3.4 分析探针标记的特点
3.4.1 即加即用型的探针结合在微管外侧的羧基端
3.4.2 探针标记呈剂量依赖的灵敏性
3.4.3 探针与微管的结合强度
3.4.4 探针标记具有抗光漂白特性
3.4.5 探针标记的信噪比可得到提高
3.5 探针可用于研究微管自身的动态性
3.5.1 浑浊度实验证实合适的探针加入量
3.5.2 探针标记可定量分析微管自身动态性
3.6 探针标记可用于研究微管相关蛋白的功能
3.6.1 探针标记不会干扰EB1和MCAK对微管崩塌的调控
3.6.2 探针标记不会干扰chTOG对微管聚合解聚的调控
3.6.3 探针标记不会干扰Kinesin-1 的滑动和DCX与微管的结合
3.7 探针标记可用于微管密码调控微管动态性研究的应用示例
3.7.1 敲低微管乙酰化三个修饰酶及微管乙酰化水平检测
3.7.2 探针标记可用于研究微管乙酰化调控的微管动态性
3.8 小结和讨论
第4章 标记活细胞微管小肽片段的筛选
4.1 噬菌体展示技术筛选出来的小肽片段
4.2 基于微管相关蛋白筛选的小肽片
4.3 小结和讨论
第5章 未来研究和展望
参考文献
攻读学位期间发表的学术论著
致谢
本文编号：3685345
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 前言
1.1 微管的结构和功能
1.1.1 微管的组成和结构
1.1.2 微管的功能体现
1.2 微管的动态不稳定性
1.2.1 动态是微管的显著特征
1.2.2 微管动态的结构基础
1.2.3 微管动态调控
1.2.4 马达蛋白Kinesin-1
1.3 微管的成像方法
1.3.1 体外重构微管的成像方法
1.3.2 细胞内微管的成像方法
1.4 研究目的和研究内容
1.4.1 研究目的
1.4.2 研究内容
第2章 实验材料与方法
2.1 实验试剂与材料
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 噬菌体筛选多肽
2.3.2 制纯化微管蛋白亲和柱
2.3.3 纯化微管蛋白
2.3.4 微管蛋白的荧光标记
2.3.5 微管相关蛋白的纯化
2.3.6 微管共沉降实验
2.3.7 探针标记微管的相关实验
2.3.8 基因干扰实验
2.3.9 免疫印迹实验
2.3.10 免疫荧光实验
2.3.11 体外探针孵育活细胞实验
2.3.12 小肽质粒转染实验
2.3.13 定量分析方法
第3章 实验结果
3.1 探针设计与合成
3.1.1 微管探针的设计
3.1.2 探针识别单元的淘选
3.1.3 探针的合成
3.2 成功搭建基于全内反射荧光显微镜的体外微管研究技术体系
3.3 探针标记体外重构的微管
3.3.1 合成的初步探针不能标记微管
3.3.2 改造后的探针可以标记微管
3.4 分析探针标记的特点
3.4.1 即加即用型的探针结合在微管外侧的羧基端
3.4.2 探针标记呈剂量依赖的灵敏性
3.4.3 探针与微管的结合强度
3.4.4 探针标记具有抗光漂白特性
3.4.5 探针标记的信噪比可得到提高
3.5 探针可用于研究微管自身的动态性
3.5.1 浑浊度实验证实合适的探针加入量
3.5.2 探针标记可定量分析微管自身动态性
3.6 探针标记可用于研究微管相关蛋白的功能
3.6.1 探针标记不会干扰EB1和MCAK对微管崩塌的调控
3.6.2 探针标记不会干扰chTOG对微管聚合解聚的调控
3.6.3 探针标记不会干扰Kinesin-1 的滑动和DCX与微管的结合
3.7 探针标记可用于微管密码调控微管动态性研究的应用示例
3.7.1 敲低微管乙酰化三个修饰酶及微管乙酰化水平检测
3.7.2 探针标记可用于研究微管乙酰化调控的微管动态性
3.8 小结和讨论
第4章 标记活细胞微管小肽片段的筛选
4.1 噬菌体展示技术筛选出来的小肽片段
4.2 基于微管相关蛋白筛选的小肽片
4.3 小结和讨论
第5章 未来研究和展望
参考文献
攻读学位期间发表的学术论著
致谢
本文编号：3685345
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3685345.html
教材专著
