长链非编码RNA IVRPIE抗流感病毒作用机制研究

发布时间：2022-11-01 19:08

　　流感病毒（influenza virus）对人类健康构成严重威胁,每年造成近十亿人感染及数十万人死亡。流感病毒基因组的高突变率和基因重配导致新毒株不断产生,从而逃避机体已有的适应性免疫,造成现有防控措施部分失效。流感病毒主要侵犯机体呼吸系统,重则发展为急性呼吸窘迫综合征,导致患者死亡。机体天然免疫反应在对抗流感病毒中起重要作用,但过度免疫反应造成的“细胞因子风暴”是导致急性肺损伤的重要原因。因此,进一步深入研究流感病毒的免疫机制对更有效地防控流感病毒至关重要。目前对流感病毒免疫机制的研究多集中在蛋白分子上,而对RNA分子在其中所起作用研究较少。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是近年来发现的一类新的非编码RNA,在发育分化、癌症、心血管疾病、免疫反应等生命活动中发挥重要作用。尽管已有报道少数lnc RNA参与机体抗病毒免疫,但仍存在大量功能未知的lnc RNA,在流感病毒免疫反应中的作用有待进一步研究。因此,探索lnc RNA在抗流感病毒中的作用及机制,将有助于进一步理解机体对流感病毒的免疫反应机制,为开发新型抗流感病毒方法及药物提供理论依据。基... 

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
第一章 IVRPIE在 IAV感染后的表达情况及对IAV增殖的作用
    1.1 实验材料
        1.1.1 细胞系
        1.1.2 病毒
        1.1.3 实验动物
        1.1.4 表达载体及克隆载体
        1.1.5 主要试剂
        1.1.6 主要仪器和设备
        1.1.7 生物信息学及统计分析软件
    1.2 实验方法
        1.2.1 病毒感染细胞及样品收集
        1.2.2 poly I:C转染细胞
        1.2.3 IFN-β刺激细胞
        1.2.4 信号通路抑制剂处理细胞
        1.2.5 RT-q PCR检测lnc RNA表达
        1.2.6 质粒构建
        1.2.7 细胞转染接毒实验
        1.2.8 HA试验测定IAV效价
        1.2.9 对IVRPIE蛋白编码能力进行预测
        1.2.10 Rapid amplification of c DNA ends(RACE)
        1.2.11 统计学分析
    1.3 实验结果
        1.3.1 IVRPIE在 IAV感染后表达升高
        1.3.2 IVRPIE抑制IAV复制
        1.3.3 IVRPIE在 IAV感染后表达具有时间依赖性及剂量依赖性
        1.3.4 IVRPIE在多种病毒感染后表达升高
        1.3.5 IVRPIE在 poly I:C刺激后升高
        1.3.6 IVRPIE主要在肺上皮细胞表达
        1.3.7 IVRPIE基本性质
        1.3.8 IVRPIE表达调控机制探究
    1.4 讨论
    1.5 小结
第二章 IVRPIE通过促进IFNβ1 及几个重要ISG的表达发挥抗病毒作用
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 病毒
        2.1.3 实验动物
        2.1.4 重组质粒及反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)
        2.1.5 主要试剂
        2.1.6 主要仪器和设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞转染接毒实验
        2.2.2 HA试验测定病毒滴度
        2.2.3 空斑形成试验测定病毒滴度
        2.2.4 组织半数致死量(median tissue culture infective dose,TCID50)试验测定病毒滴度
        2.2.5 RT-q PCR检测IFNβ1及ISG表达
        2.2.6 Western blotting
        2.2.7 ELISA实验测定细胞因子含量
        2.2.8 统计学分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 HA试验表明IVRPIE抑制IAV复制
        2.3.2 空斑形成试验表明IVRPIE抑制IAV复制
        2.3.3 Western blotting实验表明IVRPIE抑制IAV复制
        2.3.4 TCID50 实验证明IVRPIE抑制VSV复制
        2.3.5 IVRPIE不通过调控TANK基因表达发挥抗病毒作用
        2.3.6 IVRPIE不通过调控RIG-I信号通路抗病毒作用
        2.3.7 IVRPIE通过调控IFNβ1 及几个关键ISG的表达发挥抗病毒作用
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 IVRPIE通过与hn RNP U相互作用改变组蛋白修饰调控IFNβ1及ISG的表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞系
        3.1.2 病毒
        3.1.3 重组质粒及ASO
        3.1.4 主要试剂
        3.1.5 主要仪器和设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞转染接毒实验
        3.2.2 核质分离实验
        3.2.3 染色质免疫沉淀-定量PCR实验(Chromatinimmunoprecipitation-quantitative PCR,Ch IP-q PCR)
        3.2.4 RNA pull-down实验
        3.2.5 RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)
        3.2.6 hn RNP U敲降实验
        3.2.7 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 IVRPIE主要分布于细胞核中
        3.3.2 IVRPIE通过改变染色质构象调控IFNβ1及ISG表达
        3.3.3 hnRNP U是与IVRPIE相互作用的蛋白分子
        3.3.4 敲降hn RNP U导致IFNβ1及ISG表达显著降低
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 IVRPIE在小鼠体内具有抑制病毒复制的作用
    4.1 实验材料
        4.1.1 细胞系
        4.1.2 病毒
        4.1.3 实验动物
        4.1.4 表达载体及克隆载体
        4.1.5 主要试剂
        4.1.6 主要仪器和设备
        4.1.7 生物信息学及统计分析软件
    4.2 实验方法
        4.2.1 p VAX1-IVRPIE构建
        4.2.2 小鼠感染实验
        4.2.3 小鼠肺组织中IVRPIE表达量检测
        4.2.4 小鼠肺脏病毒滴度检测
        4.2.5 小鼠肺组织湿干比检测
        4.2.6 小鼠肺脏病理检测
        4.2.7 小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)收集及细胞因子检测
        4.2.8 统计学分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 IVRPIE在小鼠肺部表达
        4.3.2 IVRPIE过表达能降低小鼠感染IAV后死亡率
        4.3.3 IVRPIE过表达降低小鼠感染IAV后肺组织病毒滴度
        4.3.4 IVRPIE过表达能减轻小鼠感染IAV后肺损伤
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论与展望
参考文献
作者在学期间取得的学术成果
主要简历
致谢



本文编号：3699934