分子伴侣CpkA对D-氨基酰化酶活性影响的研究

发布时间：2022-12-04 02:13

　　分子伴侣是一类高度保守的蛋白质,在细胞内有高水平的表达,在蛋白质的折叠、装配、运输以及降解等过程中发挥着决定性的作用,并能够有效保护蛋白质折叠结构。D-氨基酰化酶（D-aminoacylase）是一类能特异性水解N-酰基-D-氨基酸获得高纯度的水解酶。本研究以来源于M.natoriense TNJL143-2中D-氨基酰化酶DAA（1488 bp）编码的基因（DAA片段）在大肠杆菌JM109中表达的酶（JM109-pUC19-DAA）作为研究对象,研究分子伴侣CpkA对D-氨基酰化酶（D-aminoacylase）活性影响。表达鉴定结果显示各突变酶均为可溶性蛋白,活性鉴定结果显示:与M.natoriense143-2活性对比,突变酶的活性降低了0.15～0.33倍;与JM109-pUC19-DAA活性对比,V125L突变酶的活性提高了1.66倍。各突变酶与分子伴侣DE3-pET21a-CpkA共表达后,与M.natoriense TNJL143-2活性对比,JM109-pUC19-DAA与各突变酶的活性提高了1.95～3.37倍;与JM109-pUC19-DAA对比,各突变酶的活性提高... 

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 D-氨基酸
        1.1.1 D-氨基酸概念
        1.1.2 存在于微生物、动物、植物、人体中的D-氨基酸
        1.1.3 D-氨基酸的味感
        1.1.4 D-氨基酸的用途
    1.2 D-氨基酰化酶
        1.2.1 D-氨基酰化酶的概念
        1.2.2 D-氨基酰化酶的分类
        1.2.3 D-氨基酰化酶的应用
        1.2.4 来源于M.natoriense中的D-氨基酰化酶
    1.3 分子伴侣
        1.3.1 分子伴侣的发现
        1.3.2 分子伴侣的分类和分布
        1.3.3 分子伴侣的作用
        1.3.4 分子伴侣的应用前景
        1.3.5 热休克蛋白60(HSP60)
        1.3.6 在超嗜热古细菌Thermococcus kodakarensis中的分子伴侣
    1.4 本文研究的目的及研究内容
        1.4.1 研究目的
        1.4.2 研究内容
第2章 恢复菌种
    2.1 实验材料
        2.1.1 主要仪器
        2.1.2 主要试剂和试剂盒
        2.1.3 实验菌株
        2.1.4 溶液及培养基配置
    2.2 实验方法
        2.2.1 JM109-pUC19-DAA菌种的恢复与鉴定
        2.2.2 M.TNJL143-2菌种的恢复与鉴定
        2.2.3 DE3-pET21a-CpkA菌种的恢复与鉴定
        2.2.4 DE3-pACYCDuet1-CpkA菌种的恢复与鉴定
    2.3 实验结果
        2.3.1 JM109-pUC19-DAA菌种的鉴定结果
        2.3.2 M.TNJL143-2菌种的鉴定结果
        2.3.3 DE3-pET21a-CpkA菌种的鉴定结果
        2.3.4 DE3-pACYCDuet1-CpkA菌种的鉴定结果
    2.4 本章小结
第3章 定点突变重组质粒JM109-pUC19-DAA
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要仪器
        3.1.2 主要试剂和试剂盒
        3.1.3 实验菌株
        3.1.4 溶液及培养基配置
    3.2 实验方法
        3.2.1 JM109-pUC19-DAA质粒的提取
        3.2.2 定点突变JM109-pUC19-DAA质粒
        3.2.3 鉴定PCR产物
        3.2.4 突变菌的转化
        3.2.5 突变菌种的培养、提取与鉴定
        3.2.6 突变质粒双酶切反应
        3.2.7 PCR DAA片段(1488 bp)鉴定各突变质粒
    3.3 实验结果
        3.3.1 定点突变后PCR产物的鉴定结果
        3.3.2 突变质粒的鉴定结果
        3.3.3 突变质粒双酶切反应的鉴定结果
        3.3.4 PCR DAA片段(1488 bp)的鉴定结果
        3.3.5 突变质粒JM109-pUC19-DAA测序结果
    3.4 本章小结
第4章 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA的构建
    4.1 实验材料
        4.1.1 主要仪器
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 实验菌株
        4.1.4 培养基及溶液
    4.2 实验方法
        4.2.1 目的基因DAA的获取
        4.2.2 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA的提取
        4.2.3 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA双酶切
        4.2.4 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA去磷酸化
        4.2.5 目的基因与重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA连接
        4.2.6 构建携带重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA重组菌
        4.2.7 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA的提取与鉴定
    4.3 实验结果
        4.3.1 PCR产物的鉴定结果
        4.3.2 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA的鉴定结果
        4.3.3 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA双酶切反应的鉴定结果
        4.3.4 重组质粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA测序结果
    4.4 本章小结
第5章 酶的表达与活性鉴定
    5.1 实验材料
        5.1.1 主要仪器
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 实验菌株
        5.1.4 培养基及溶液
    5.2 实验方法
        5.2.1 菌种培养及粗酶液的获取
        5.2.2 酶的表达鉴定
        5.2.3 标准曲线的制作
        5.2.4 鉴定酶的活性
    5.3 实验结果
        5.3.1 酶表达的鉴定结果
        5.3.2 活性的鉴定结果
        5.3.3 活性对比的结果
        5.3.4 重组菌中DAA活性结果
    5.4 本章小结
第6章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
附录A 重组载体R103A测序结果
附录B 重组载体R103K测序结果
附录C 重组载体V125K测序结果
附录D 重组载体V125L测序结果
附录E 重组载体A196K测序结果
附录F 重组载体V296L测序结果
附录G 重组载体V296K测序结果
附录H 重组载体DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA测序结果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]D-氨基酰化酶的研究进展[J]. 郑文宾,郑仁朝,郑裕国.  基因组学与应用生物学. 2014(03)
[2]氟胺氰菊酯的合成[J]. 祝捷,方维臻,陆群.  农药. 2011(07)
[3]人类味觉与氨基酸味道[J]. 蒋滢,徐颖,朱庚伯.  氨基酸和生物资源. 2002(04)
[4]左旋对羟基苯甘氨酸的技术进展[J]. 王京平,智瑞彩.  河北化工. 1999(04)
[5]化学酶法合成D-对羟基苯甘氨酸[J]. 许激扬,吴梧桐,公剑,倪孟祥.  中国药科大学学报. 1998(05)
[6]D—氨基酸在人体的来龙去脉──人体中D－氨基酸、D－氨基酸氧化酶、D－天冬氨酸氧化酶研究进展[J]. 赵南生，余志立.  氨基酸和生物资源. 1995(02)



本文编号：3707414