红树林放线菌的分离鉴定及其rpf基因复苏活性研究

发布时间：2022-12-05 00:27

　　自然界中当细菌面临胁迫环境时,进入一种称为非可培养状态（VBNC:viable but non-culturable）,这种状态导致我们在实验室中分离出来的菌株只占环境的0.01%-4%。复苏促进因子（Resuscitation-promoting factor,Rpf）是一种有促进细菌复苏作用的蛋白质,在很低的浓度可以促进非可培养状态的细菌复苏,对正常生长的细菌也具有促进生长的作用。编码复苏促进因子基因的片段广泛在放线菌中存在。在红树林中,有丰富的放线菌资源,并且具有酶活性、抗肿瘤活性、抗病毒活性以及对一些病原菌和线虫有拮抗作用等多种生物活性。为了发掘红树林中更多的放线菌资源,本文对放线菌的rpf基因进行了克隆、表达、及对表达蛋白进行活性检测。从红树林来源的根际土壤样品经过排重后,分离出42株放线菌,16S rRNA基因扩增及鉴定结果表明42株放线菌分别属于放线菌纲下的5个目6个科8个属。这五个目分别是微球菌亚目（Micrococcineae）、链霉菌亚目（Streptomycetales）、小单孢菌亚目（Micromonosporineae）、棒杆菌亚目（Corynebacteri... 

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摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 红树林放线菌多样性
        1.1.1 红树林的分布
        1.1.2 红树林根际土壤的放线菌的多样性
        1.1.3 红树林放线菌的新类群
        1.1.4 来源于红树林的放线菌的生物活性
        1.1.5 红树林放线菌资源的利用
    1.2 非可培养状态的形成和复苏
        1.2.1 VBNC诱导因素和形态
        1.2.2 VBNC状态与其他一些细胞状态的区别
        1.2.3 VBNC状态的复苏
        1.2.4 VBNC状态的检测
    1.3 Rpf的研究进展
        1.3.1 Rpf的发现
            1.3.1.1 分枝杆菌的复苏促进因子
            1.3.1.2 红平红球菌的复苏促进因子
            1.3.1.3 放线菌的复苏促进因子
        1.3.2 Rpf的生物学特征
        1.3.3 Rpf的作用机制
        1.3.4 Rpf的应用
    1.4 课题研究的目的及意义
第二章 红树林放线菌多样性及其酶活性检测
    2.1 引言
    2.2 主要材料
        2.2.1 土壤样品
        2.2.2 培养基
    2.3 主要试剂和仪器
        2.3.1 主要试剂
        2.3.2 缓冲溶液
        2.3.3 主要仪器
    2.4 实验方法
        2.4.1 土壤样品的处理
        2.4.2 放线菌的分离纯化、保藏
        2.4.3 放线菌DNA的提取
            2.4.3.1 chelex法提取细菌DNA
            2.4.3.2 酶解法小量提取放线菌DNA
        2.4.4 16S rRNA基因扩增及鉴定
        2.4.5 序列分析及系统发育树的构建
        2.4.6 放线菌酶活性检测
    2.5 实验结果
        2.5.1 放线菌的多样性
        2.5.2 潜在新种
        2.5.3 放线菌的活性多样性
    2.6 讨论
第三章 放线菌Rpf生物信息分析及其克隆表达载体的构建
    3.1 主要材料和仪器
        3.1.1 实验菌株和质粒
        3.1.2 培养基及其他试剂
            3.1.2.1 培养基
            3.1.2.2 主要试剂
            3.1.2.3 缓冲溶液
        3.1.3 主要仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 引物的设计与合成
        3.3.2 rpf基因的筛选
        3.3.3 生物信息学分析
        3.3.4 放线菌rpf-3 基因克隆载体的构建与重组质粒的转化
            3.3.4.1 P_(easy)-T1-rpf-3克隆载体的构建
            3.3.4.2 感受态细胞的制备
            3.3.4.3 重组质粒的转化
        3.3.5 pET28a-rpf-3表达载体的构建
            3.3.5.1 质粒的提取
            3.3.5.2 pET28a+的双酶切
            3.3.5.3 pET28a-rpf-3表达载体的构建
    3.4 实验结果
        3.4.1 基因筛选结果
        3.4.2 生物信息分析
            3.4.2.1 放线菌Rpf理化性质及疏水性分析
            3.4.2.2 放线菌Rpf蛋白的信号肽与磷酸位点的分析
            3.4.2.3 放线菌Rpf蛋白二级结构及结构域分析
            3.4.2.4 放线菌Rpf物种间同源性分析和蛋白系统发育树
            3.4.2.5 放线菌Rpf蛋白的三级结构预测
        3.4.3 P_(easy)-T1-rpfs克隆载体的构建
        3.4.4 pET28a-rpf-3 重组原核表达载体的鉴定
    3.5 讨论
第四章 放线菌Rpf重组蛋白的表达与纯化及活性检测
    4.1 主要材料和试剂
        4.1.1 培养基
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 缓冲溶液
        4.1.4 主要仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 重组基因在大肠杆菌中的蛋白表达与纯化
            4.3.1.1 重组基因在大肠杆菌中的蛋白表达
            4.3.1.2 SDS-PAGE的制备
            4.3.1.3 蛋白的SDS-PAGE检测
            4.3.1.4 镍柱的装填
            4.3.1.5 蛋白的纯化
        4.3.2 重组蛋白对藤黄微球菌的复苏促进作用
            4.3.2.1 藤黄微球菌VBNC状态诱导
            4.3.2.2 Rpf蛋白对VBNC状态菌体的复苏作用
    4.4 实验结果
        4.4.1 重组蛋白的表达
        4.4.2 蛋白纯化结果
        4.4.3 重组蛋白对藤黄微球菌的复苏促进作用
    4.5 讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
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【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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[2]五株海洋来源放线菌次级代谢产物及其活性研究[D]. 车茜.中国海洋大学 2013

硕士论文
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[2]广西北仑河口红树林根际土壤放线菌多样性及抗菌活性研究[D]. 吴越.桂林医学院 2017
[3]福建省红树林稀有放线菌的多样性及筛选[D]. 王丽.福建医科大学 2015
[4]几种常见致病菌的活的非可培养状态研究[D]. 杜萌.中国海洋大学 2007



本文编号：3709293