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乳杆菌S-层蛋白的肠道免疫调节功能及作用机制研究

发布时间:2022-12-11 07:50
  近年来,有助于促进胃肠道健康、调节机体免疫功能的食源性功能因子逐渐成为食品营养领域的研究热点。乳杆菌作为一类GRAS级的肠道益生菌,其可通过竞争肠道上皮细胞结合位点、干扰致病菌在肠道内的定殖、产生细菌素、降低结肠pH以及对免疫系统产生非特异性刺激对机体进行免疫调节。乳杆菌益生特性的发挥与其所携带的S-层蛋白(Surface-layer protein,简称Slp)有关,Slp具有多重益生特性,但其在免疫调节特性方面的研究仍不够充分。因此,本研究旨在深入探究乳杆菌Slp的肠道免疫调节功能及相关作用机制,挖掘Slp对乳杆菌益生特性的生物学贡献,拓展和丰富人们对乳杆菌Slp特性的认知。主要研究结果如下:以携带已知Slp的L.acidophilus NCFM为参照菌株,从收集到的15株乳杆菌中筛选出了6株携带Slp的乳杆菌。纯化其氯化锂提取物后,获得6种电泳纯且相对分子质量为46,000的Slp。采用差示扫描量热仪对这6种乳杆菌Slps的热变性温度检测后得出:6种乳杆菌Slps的热变性图谱中均只出现一个吸热峰,且它们的热变性温度在58-77°C之间。其中L.crispatus JCM 2009... 

【文章页数】:114 页

【学位级别】:博士

【文章目录】:
摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
第一章 绪论
    1.1 乳杆菌S-层蛋白的概述
        1.1.1 乳杆菌S-层蛋白简介
        1.1.2 乳杆菌S-层蛋白的益生特性
    1.2 促炎症因子激活的肠道炎症反应
        1.2.1 LPS及其激活的肠道炎症反应
        1.2.2 TNF-α及其激活的肠道炎症反应
    1.3 乳杆菌S-层蛋白免疫调节研究进展
        1.3.1 对肠上皮细胞的免疫调节
        1.3.2 对巨噬细胞的免疫调节
    1.4 乳杆菌及其表面成分对肠道肿瘤细胞的免疫调节
        1.4.1 乳杆菌及其表面成分对肿瘤细胞免疫调节的研究进展
        1.4.2 乳杆菌及其表面成分对肿瘤细胞免疫调节的作用机制
    1.5 论文立题背景及意义
    1.6 论文的主要研究内容
第二章 携带S-层蛋白乳杆菌的筛选及其S-层蛋白的鉴定分析
    2.1 前言
    2.2 实验材料与设备
        2.2.1 实验菌株与试剂
        2.2.2 实验仪器设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 乳杆菌的活化及培养
        2.3.2 乳杆菌氯化锂提取物的制备
        2.3.3 透射电子显微镜观察乳杆菌表层结构
        2.3.4 氯化锂提取物中S-层蛋白的鉴定
        2.3.5 乳杆菌S-层蛋白的纯化
        2.3.6 乳杆菌S-层蛋白热变性温度分析
        2.3.7 数据统计与分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 乳杆菌氯化锂提取物的SDS-PAGE分析
        2.4.2 乳杆菌S-层结构的显微观察
        2.4.3 S-层蛋白的分离纯化
        2.4.4 S-层蛋白的热力学特性
    2.5 本章小结
第三章 乳杆菌S-层蛋白对巨噬细胞的抗炎免疫调节作用及相关机制
    3.1 前言
    3.2 实验材料与设备
        3.2.1 实验细胞株与试剂
        3.2.2 实验仪器设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 乳杆菌S-层蛋白的制备
        3.3.2 细胞培养
        3.3.3 乳杆菌S-层蛋白的细胞毒性
        3.3.4 LPS诱导RAW264.7 细胞炎症模型的建立
        3.3.5 RAW264.7细胞形态的观察
        3.3.6 RAW264.7 细胞内产生ROS荧光强度及含量分析
        3.3.7 RAW264.7 细胞内TNF-α,IL-1β,PGE2和NO分泌水平的检测
        3.3.8 细胞内目的蛋白表达水平的检测
        3.3.9 细胞内NF-κBp65核转位观察
        3.3.10 数据统计与分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 S-层蛋白对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用
        3.4.2 LPS最佳作用时间及最佳作用浓度的确定
        3.4.3 S-层蛋白对LPS刺激的RAW264.7 细胞活性及其形态的影响
        3.4.4 S-层蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞内ROS生成的影响
        3.4.5 S-层蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞内TNF-α和 IL-1β分泌水平的影响
        3.4.6 S-层蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞内NO和 PGE2分泌水平的影响
        3.4.7 S-层蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞内MAPK信号通路的影响
        3.4.8 S-层蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞内NF-κB信号通路的影响
        3.4.9 S-层蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞内NF-κB p65 核转位的影响
    3.5 本章小结
第四章 乳杆菌S-层蛋白对肠上皮细胞屏障的免疫保护作用及相关机制
    4.1 前言
    4.2 材料与设备
        4.2.1 实验细胞株与试剂
        4.2.2 实验仪器设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 乳杆菌S-层蛋白的制备
        4.3.2 Caco-2细胞的培养及肠上皮屏障模型的建立
        4.3.3 S-层蛋白最佳浓度的确定
        4.3.4 肠上皮屏障损伤模型的建立
        4.3.5 肠上皮屏障细胞间跨膜电阻的测定
        4.3.6 肠上皮屏障细胞间通透性的测定
        4.3.7 IL-8的检测
        4.3.8 细胞凋亡率检测
        4.3.9 细胞凋亡检测
        4.3.10 细胞内目标蛋白表达水平的检测
        4.3.11 细胞内NF-κBp65核转位观察
        4.3.12 数据统计与分析
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 S-层蛋白对Caco-2细胞的毒性作用
        4.4.2 S-层蛋白对肠上皮屏障细胞间跨膜电阻的影响
        4.4.3 S-层蛋白对肠上皮屏障细胞间通透性的影响
        4.4.4 TNF-α的最佳作用时间及浓度的确定
        4.4.5 S-层蛋白对TNF-α诱导的肠上皮屏障细胞间跨膜电阻及通透性的影响
        4.4.6 S-层蛋白对TNF-α诱导的肠上皮屏障细胞间紧密连接蛋白的影响
        4.4.7 S-层蛋白对TNF-α诱导的肠上皮细胞内IL-8 分泌水平的影响
        4.4.8 S-层蛋白对TNF-α诱导的肠上皮细胞凋亡的影响
        4.4.9 S-层蛋白对TNF-α诱导的肠上皮细胞内NF-κB p65 核转位的影响
    4.5 本章小结
第五章 乳杆菌S-层蛋白对肠道肿瘤细胞活性的影响及相关机制
    5.1 前言
    5.2 实验材料与设备
        5.2.1 实验细胞株及试剂
        5.2.2 实验仪器设备
    5.3 实验方法
        5.3.1 乳杆菌S-层蛋白的制备
        5.3.2 细胞培养
        5.3.3 相对细胞活性的评估
        5.3.4 AO染色
        5.3.5 细胞内ROS水平检测
        5.3.6 细胞周期分析
        5.3.7 细胞凋亡率检测
        5.3.8 细胞内目标蛋白表达水平的检测
        5.3.9 数据统计与分析
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 S-层蛋白对HCT116和CCD841 Co N细胞活性及数目的影响
        5.4.2 S-层蛋白对HCT116细胞凋亡的影响
        5.4.3 S-层蛋白对HCT116细胞自噬的影响
        5.4.4 S-层蛋白对HCT116 细胞内PI3K/AKT/m TOR信号通路的影响
        5.4.5 S-层蛋白对HCT116 细胞内MAPK信号通路的影响
        5.4.6 S-层蛋白对HCT116 细胞内ROS分泌水平的影响
        5.4.7 ROS对 S-层蛋白诱导的HCT116 细胞自噬的影响
        5.4.8 S-层蛋白对HCT116细胞周期的影响
    5.5 本章小结
第六章 乳杆菌S-层蛋白激活自噬缓解巨噬细胞炎症的相关机制
    6.1 前言
    6.2 实验材料与设备
        6.2.1 实验细胞株与试剂
        6.2.2 实验仪器设备
    6.3 实验方法
        6.3.1 乳杆菌S-层蛋白的制备
        6.3.2 细胞培养
        6.3.3 LPS诱导RAW264.7 细胞炎症模型的建立
        6.3.4 细胞分组处理
        6.3.5 细胞内NO和PGE2的分泌水平检测
        6.3.6 细胞内目标蛋白表达水平的检测
        6.3.7 数据统计与分析
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 S-层蛋白对LPS诱导RAW264.7 细胞内自噬活性的影响
        6.4.2 S-层蛋白对LPS诱导RAW264.7 细胞内PI3K/AKT/m TOR信号通路的影响
        6.4.3 S-层蛋白对LPS诱导的RAW264.7 细胞内NF-κB p65 核转位的影响
        6.4.4 NF-κB抑制剂对RAW264.7 细胞内自噬活性的影响
        6.4.5 NF-κB抑制剂对RAW264.7 细胞内NO和 PGE2分泌水平的影响
        6.4.6 S-层蛋白基于自噬对RAW264.7 细胞内NF-κB信号通路的影响
        6.4.7 S-层蛋白基于自噬对RAW264.7 细胞内NO和 PGE2分泌水平的影响
    6.5 本章小结
论文主要结论与展望
    主要结论
    展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文


【参考文献】:
期刊论文
[1]植物乳杆菌代谢产物诱导人结肠癌细胞系LoVo细胞的凋亡作用[J]. 关宏,张杰,孙永旭,刘伯阳,王睿,王慧荣,刘韩,王丽萍,刘吉成.  齐齐哈尔医学院学报. 2015(15)
[2]Blocking NF-kB nuclear translocation leads to p53-related autophagy activation and cell apoptosis[J]. Bao-Song Zhu, Chun-Gen Xing, Kui Zhao, Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Fang Lin, Zheng-Hong Qin, Laboratory of Aging and Nervous Diseases, Soochow University School of Medicine, Suzhou 215123, Jiangsu Province, China Xiao-Qing Fan, Department of General Surgery, The Second Hospital Of Jiaxing City, Jiaxing 314000, Jiangsu Province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2011(04)
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博士论文
[1]乳杆菌表层蛋白的理化性质和生物学功能研究[D]. 孟珺.江南大学 2016
[2]益生乳酸杆菌的黏附及免疫调节作用研究[D]. 任大勇.吉林大学 2013
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[4]转录因子NF-kB信号通路在胰腺炎发生中的机制研究[D]. 黄浩杰.第二军医大学 2012
[5]嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白拮抗肠道病原菌粘附或入侵宿主细胞机制的研究[D]. 李鹏成.南京农业大学 2011

硕士论文
[1]高黏附乳酸菌的筛选及其对RAW264.7细胞的免疫调节作用[D]. 占萌.东北农业大学 2019
[2]乳酸杆菌S层蛋白对HT-29细胞TLR4-MyD88-NF-κB信号通路及凋亡的影响[D]. 郝思琪.哈尔滨工业大学 2018
[3]乳杆菌表层蛋白对菌株性质的影响及其生物学功能[D]. 赵彬彬.江南大学 2017
[4]植物乳杆菌ZDY2013表层蛋白及其益生特性的初步探究[D]. 谢琼.南昌大学 2017
[5]嗜酸乳杆菌S-层蛋白激活巨噬细胞免疫调节作用的信号机制研究[D]. 吴梦亭.南京师范大学 2017
[6]两种乳酸杆菌的S-层蛋白对HT-29细胞的免疫调节功能研究[D]. 向鑫玲.哈尔滨工业大学 2016
[7]乳酸菌表层蛋白的性质、结构与功能[D]. 朱晓.江南大学 2012
[8]乳酸杆菌发酵液对人结肠癌细胞的抑制作用及其机理[D]. 万莹.大连医科大学 2012
[9]脑外伤后细胞核因子κB(NF-κB)信号通路对自噬过程的调节及机制探讨[D]. 李生兴.苏州大学 2008



本文编号:3718404

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