在CHO-K1细胞基因组内定点整合表达人血清白蛋白的研究

发布时间：2023-01-04 09:42

　　中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）已是应用最为广泛的生物技术药物生产细胞,构建稳定表达治疗性生物制品的CHO工程细胞系一直是研究工作的热点。课题组前期组合应用慢病毒示踪报告基因及染色体步移技术,在CHO-K1基因组内发现6个可持续表达报告基因的位点。本研究对其中一个位点进行了表达稳定性的验证工作,并分别实现了绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因和人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）基因在该位点的定点整合和稳定表达。一、以整合了Zs Green1报告基因的CHO-K1-ZsGreen1-2C6细胞为研究材料,组合使用倒置荧光显微镜和流式细胞术,定量分析了ZsGreen1报告基因的表达情况。按照主细胞库到2000 L细胞生产罐放大培养的细胞代次需求,连续传代培养50代次,发现100%的CHO-K1-Zs Green1-2C6贴壁和悬浮细胞均可稳定表达ZsGreen1报告基因,提示CHO-K1细胞LOC103162981基因NW＿003626341.1内第1689碱基（... 

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 工程细胞简介
        1.1.1 常用的工程细胞
        1.1.2 CHO细胞简介
    1.2 CHO工程细胞的构建
        1.2.1 CHO细胞的表达优势
        1.2.2 CHO工程细胞构建的传统方法
        1.2.3 CHO工程细胞的存在问题
    1.3 CHO工程细胞的研究进展
        1.3.1 抗凋亡工程
        1.3.2 基因位点特异性整合
    1.4 本文研究背景和研究内容
        1.4.1 研究背景
        1.4.2 研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 细胞株和菌株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 培养基
        2.1.5 主要试剂及溶液
        2.1.6 仪器和设备
        2.1.7 分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养与保藏
        2.2.2 MTT法检测CHO-K1-ZsGreen1-2C6 贴壁细胞的倍增时间
        2.2.3 倒置荧光显微镜观察ZsGreen1 蛋白表达情况
        2.2.4 流式细胞仪检测细胞平均荧光强度
        2.2.5 Zsgreen1 蛋白转录水平分析
        2.2.6 sgRNA设计与质粒构建
        2.2.7 sgRNA可编辑性验证
        2.2.8 供体质粒的设计与构建
        2.2.9 细胞转染和单克隆筛选
        2.2.10 目的基因定点整合的鉴定
        2.2.11 目的蛋白质的表达鉴定
        2.2.12 目的蛋白细胞表达水平的检测
第三章 结果与讨论
    3.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 细胞生长曲线
    3.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 细胞表达ZsGreen1 报告基因的稳定性评价
        3.2.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 贴壁细胞内ZsGreen1 基因的表达情况
        3.2.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 悬浮细胞内ZsGreen1 基因的表达情况
        3.2.3 不同代次CHO-K1-ZsGreen1-2C6 细胞内ZsGreen1 基因转录水平检测
    3.3 sgRNA质粒的验证及阳性克隆筛选
    3.4 sgRNA编辑效率验证
    3.5 定点整合基因的鉴定
        3.5.1 定点整合EGFP基因细胞株的鉴定
        3.5.2 定点整合HSA基因细胞株的鉴定
    3.6 目的蛋白表达的鉴定
        3.6.1 EGFP基因表达的鉴定
        3.6.2 HSA基因表达的鉴定
    3.7 EGFP报告基因的表达稳定性评价
    3.8 HSA基因表达水平检测
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较[J]. 刘燕,任卫红,王绿娅,张晓萍,高诗娟,武威,李凤娟,杜杰.  心肺血管病杂志. 2016(07)
[2]提高哺乳动物工程细胞抗凋亡能力的基因策略[J]. 徐洪记,张兵兵.  中国生物工程杂志. 2012(06)

博士论文
[1]CHO细胞定点整合稳定表达治疗性蛋白质的研究[D]. 周松涛.江南大学 2019



本文编号：3727545