基于CRISPR/Cas9的一种胞嘧啶碱基编辑器的初步探究

发布时间：2023-01-12 13:20

　　CRISPR/Cas9技术在目标位点引入双链DNA断裂（DSBs）作为修复基因的第一步,很容易导致基因缺失等突变。因此,研究人员开发了一种新的基因组编辑方法-碱基编辑器。它可以直接将一个碱基或碱基对转换成另一个碱基对,从而在细胞中有效地诱导点突变,此外,CRISPR/Cas9衍生的碱基编辑也提高了修复基因组中点突变的效率。本课题通过将人源的胞苷脱氨酶（AID）分别替代CRISPR/Cas9蛋白中的HNH结构域和RuvC-like结构域,重新设计一种新型的碱基编辑器,检测这种新型碱基编辑器的碱基编辑窗口和编辑效率。首先尝试对碱基编辑器进行体外功能实验,通过将spCas9中的HNH结构域和RuvC-like结构域分别替换为AID蛋白,获得8种dCas9重组质粒,然后在蛋白N端连接上UGI序列,获得dCas9-AID蛋白;同时在体外设计出特定的的sgRNA,通过体外转录纯化等步骤获得100bp的sgRNA;根据sgRNA的序列设计底物DNA序列,通过PCR扩增获得大量的DNA片段。使用原核表达系统体外纯化碱基编辑蛋白,将重组蛋白分别进行GST亲和层析、Ni亲和层析、肝素琼脂糖凝胶层析（Hep... 

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 课题研究的背景和意义
    1.2 基因编辑技术的发展
    1.3 单碱基编辑器简介
        1.3.1 胞嘧啶碱基编辑器的发展
        1.3.2 腺嘌呤碱基编辑器的发展
    1.4 单碱基编辑器的应用
        1.4.1 诱导点突变
        1.4.2 有丝分裂后细胞的碱基编辑
        1.4.3 碱基编辑引入终止密码子
        1.4.4 制作模型生物
        1.4.5 作为信号记录器
        1.4.6 植物的碱基编辑
    1.5 本课题主要研究内容
        1.5.1 构建蛋白表达载体
        1.5.2 构建sgRNA载体
        1.5.3 体外实验
        1.5.4 细胞内实验
    1.6 技术路线
第2章 材料与方法
    2.1 质粒细胞与菌株
    2.2 蛋白表达相关材料
    2.3 实验试剂
        2.3.1 克隆所需试剂
        2.3.2 蛋白表达相关试剂
        2.3.3 其他相关试剂
    2.4 实验仪器
    2.5 获取目的序列
    2.6 PCR扩增目的基因与载体
        2.6.1 琼脂糖凝胶电泳
        2.6.2 胶回收步骤
    2.7 酶切与连接
    2.8 重组质粒的转化
        2.8.1 TB法制备感受态细胞T1 的制备
    2.9 阳性克隆筛选
    2.10 重组质粒的提取与鉴定
        2.10.1 质粒提取步骤
    2.11 蛋白纯化
    2.12 SgRNA的体外纯化
        2.12.1 体外转录操作步骤
        2.12.2 体外纯化步骤
    2.13 T7 聚合酶的提取
    2.14 底物DNA的扩增与回收
    2.15 细胞转染
    2.16 处理细胞
    2.17 蛋白免疫印迹(Western Bloting)
    2.18 提取基因组
第3章 碱基编辑器体外功能测定
    3.1 体外重组质粒的构建
    3.2 体外sgRNA和底物DNA表达载体的构建
    3.3 融合蛋白的表达与纯化
        3.3.1 DE-HNH-dCas9 融合蛋白肝素琼脂糖凝胶层析
        3.3.2 DE-HNH-dCas9 融合蛋白过S柱
        3.3.3 DE-REC-dCas9 融合蛋白过Heparin柱
        3.3.4 不同处理方法纯化DE-REC-dCas9-S-A融合蛋白
        3.3.5 不同感受态细胞表达DE-REC-dCas9-S-A-S融合蛋白
    3.4 Wb检测蛋白表达
    3.5 本章小结
第4章 碱基编辑器细胞内功能测定
    4.1 细胞内表达载体的构建
    4.2 检测碱基编辑器的功能
        4.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达
        4.2.2 WB检测蛋白表达
        4.2.3 检测蛋白的细胞内编辑效率
    4.3 本章小结
    4.4 讨论
结论
展望
参考文献
致谢



本文编号：3729979