铜绿假单胞菌DN1参与石油烃降解基因功能及趋化性研究
发布时间：2023-03-25 00:52
石油烃化合物的污染治理是亟待解决的问题,微生物修复是一种理想的方法,而目前烃类污染物的成分复杂及疏水特性限制了降解菌对其摄取和降解。本研究以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1作为出发菌株,对其参与石油烃化合物降解及趋化性过程中的关键基因展开功能探索,以期揭示微生物如何摄取利用烃类污染物的分子转运机制,进而实现烃类污染物修复。前期的研究表明,铜绿假单胞菌DN1具有降解原油、烷烃和芳烃的能力。为进一步了解其降解机制,首先利用比较基因组学手段预测分析了6株石油烃降解菌株中烷烃羟化酶、环羟基化双加氧酶及趋化系统,比对结果显示:石油烃降解菌的降解酶系统呈现多样性,但这些基因的同源性及分布之间存在一定差异,在一定程度上影响并决定了菌株底物降解谱的多样性。其次,我们通过气相色谱技术检测了菌株DN1对原油和不同正构烷烃的降解情况,同时利用RT-qPCR技术监测了烷烃羟化酶基因的实时表达,并通过同源重组技术构建基因缺失突变株进一步研究其基因功能。实验结果表明:DN1能够利用原油和链长为8-40个碳原子的多种正构烷烃作为唯一碳源,降解率高达85%。RT-qPCR分析显示,五...
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语对照表
第一章 绪论
1.1 石油烃污染物及其治理
1.1.1 石油烃的危害及组分
1.1.2 石油烃污染物的治理技术
1.2 石油烃污染物微生物降解概述
1.2.1 石油烃降解微生物
1.2.2 石油烃降解酶
1.2.3 提高石油烃污染物降解的措施
1.3 趋化性在石油烃污染物降解过程中的作用
1.3.1 细菌趋化性概述
1.3.2 甲基受体趋化蛋白在趋化过程中的作用
1.4 本文研究内容及意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验所用菌株、质粒及引物
2.1.2 实验所用试剂
2.1.3 实验所用仪器
2.1.4 培养基及抗生素的配制
2.2 基础实验方法
2.2.1 感受态细胞的制备
2.2.2 质粒DNA的小量提取
2.2.3 目的片段的PCR及纯化回收
2.2.4 酶切和连接
2.2.5 化学转化
2.2.6 突变株的构建
2.2.7 RNA的提取、纯化及浓度测定
2.2.8 RNA反转录
2.2.9 实时荧光定量PCR
2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.3 烷烃降解酶基因功能初探
2.3.1 DN1对原油的降解
2.3.2 DN1对不同正构烷烃生物降解性能分析实验
2.3.3 原油中烷烃降解谱的测定
2.3.4 烷烃含量的测定
2.3.5 烷烃降解相关基因的预测
2.3.6 RT-qPCR分析烷烃降解酶基因的实时表达
2.3.7 烷烃羟化酶突变株的构建
2.3.8 DN1和突变株对烷烃的生物降解
2.4 趋化性在烃类污染物降解过程的作用探索
2.4.1 铜绿假单胞菌趋化系统的比较分析
2.4.2 甲基受体趋化蛋白(MCP)的结构预测及分析
2.4.3 MCP基因缺失突变株的构建
2.4.4 滴定法(Drop assay)
2.4.5 游动平板法(Swarm plate assay)
2.4.6 甲基受体趋化蛋白的体外表达及纯化
2.4.7 等温滴定热量法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)实验
第三章 结果与讨论
3.1 铜绿假单胞菌DN1参与烃类污染物降解的比较基因组学分析
3.1.1 铜绿假单胞菌属烷烃单加氧酶alk B基因簇分析
3.1.2 铜绿假单胞菌属环羟基化双加氧酶比较分析
3.1.3 铜绿假单胞菌属趋化系统分析
3.2 DN1对烷烃的降解及烷烃羟化酶基因功能分析
3.2.1 菌株DN1对原油的降解
3.2.2 菌株DN1对不同正构烷烃的生物降解
3.2.3 DN1中烷烃羟化酶编码基因分析
3.2.4 不同烷烃诱导下alk1,alkB2,p450,almA1和almA2的实时表达
3.2.5 烷烃羟化酶系统在烷烃降解中的作用
3.3 菌株DN1及部分MCP突变株的趋化性研究
3.3.1 菌株DN1的趋化性
3.3.2 部分mcp突变株对烃类污染物的趋化性
3.3.3 甲基受体趋化蛋白mcp04325基因外源表达
3.3.4 ITC分析Mcp04325蛋白与原儿茶酸的结合能力
第四章 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间取得的科研成果
本文编号：3770197
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语对照表
第一章 绪论
1.1 石油烃污染物及其治理
1.1.1 石油烃的危害及组分
1.1.2 石油烃污染物的治理技术
1.2 石油烃污染物微生物降解概述
1.2.1 石油烃降解微生物
1.2.2 石油烃降解酶
1.2.3 提高石油烃污染物降解的措施
1.3 趋化性在石油烃污染物降解过程中的作用
1.3.1 细菌趋化性概述
1.3.2 甲基受体趋化蛋白在趋化过程中的作用
1.4 本文研究内容及意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验所用菌株、质粒及引物
2.1.2 实验所用试剂
2.1.3 实验所用仪器
2.1.4 培养基及抗生素的配制
2.2 基础实验方法
2.2.1 感受态细胞的制备
2.2.2 质粒DNA的小量提取
2.2.3 目的片段的PCR及纯化回收
2.2.4 酶切和连接
2.2.5 化学转化
2.2.6 突变株的构建
2.2.7 RNA的提取、纯化及浓度测定
2.2.8 RNA反转录
2.2.9 实时荧光定量PCR
2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.3 烷烃降解酶基因功能初探
2.3.1 DN1对原油的降解
2.3.2 DN1对不同正构烷烃生物降解性能分析实验
2.3.3 原油中烷烃降解谱的测定
2.3.4 烷烃含量的测定
2.3.5 烷烃降解相关基因的预测
2.3.6 RT-qPCR分析烷烃降解酶基因的实时表达
2.3.7 烷烃羟化酶突变株的构建
2.3.8 DN1和突变株对烷烃的生物降解
2.4 趋化性在烃类污染物降解过程的作用探索
2.4.1 铜绿假单胞菌趋化系统的比较分析
2.4.2 甲基受体趋化蛋白(MCP)的结构预测及分析
2.4.3 MCP基因缺失突变株的构建
2.4.4 滴定法(Drop assay)
2.4.5 游动平板法(Swarm plate assay)
2.4.6 甲基受体趋化蛋白的体外表达及纯化
2.4.7 等温滴定热量法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)实验
第三章 结果与讨论
3.1 铜绿假单胞菌DN1参与烃类污染物降解的比较基因组学分析
3.1.1 铜绿假单胞菌属烷烃单加氧酶alk B基因簇分析
3.1.2 铜绿假单胞菌属环羟基化双加氧酶比较分析
3.1.3 铜绿假单胞菌属趋化系统分析
3.2 DN1对烷烃的降解及烷烃羟化酶基因功能分析
3.2.1 菌株DN1对原油的降解
3.2.2 菌株DN1对不同正构烷烃的生物降解
3.2.3 DN1中烷烃羟化酶编码基因分析
3.2.4 不同烷烃诱导下alk1,alkB2,p450,almA1和almA2的实时表达
3.2.5 烷烃羟化酶系统在烷烃降解中的作用
3.3 菌株DN1及部分MCP突变株的趋化性研究
3.3.1 菌株DN1的趋化性
3.3.2 部分mcp突变株对烃类污染物的趋化性
3.3.3 甲基受体趋化蛋白mcp04325基因外源表达
3.3.4 ITC分析Mcp04325蛋白与原儿茶酸的结合能力
第四章 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间取得的科研成果
本文编号：3770197
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3770197.html
教材专著
