DNA表观遗传修饰6mA抑制DNA聚合酶eta催化DNA复制的动力学研究

发布时间：2023-04-01 16:47

　　近几年报道的N6-甲基腺嘌呤(6mA)作为一种新的表观遗传标记在各种真核生物调节生命进程中起着非常重要得作用。然而,6mA影响DNA聚合酶催化DNA复制的分子机制仍然不清楚。因此本课题在分子水平上研究6mA对DNA复制的影响,我们使用Y家族人类DNA聚合酶eta作为模型并采用生物化学和生物物理的方法来研究人类DNA聚合酶eta跨过6mA进行合成的分子机制。我们的研究发现DNA模板上的6mA及其中间代谢产物次黄嘌呤(I)都会抑制DNA聚合酶eta催化DNA的复制。DNA模板上的6mA会使dTTP掺入效率降低13倍,下一个碱基插入效率下降低8.5倍。DNA模板上的I对面则更优先掺入dCTP。相比6mA:C错配,6mA:T错配会导致聚合酶eta失去优先掺入能力,并且I:C配对比I:T配对更利于碱基掺入。dTTP和dCTP分别掺入模板上6mA与I对面都具有爆发相。然而,相比于DNA模板上A对面插入dTTP,模板上的6mA通过降低碱基的插入速率和增加解离常数使得dTTP和dCTP的插入效率分别降低了2.3倍和5.6倍。生物物理结合实验则表明相比未发生甲基化的A,DNA模板上的6mA和I都降低了二...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
缩略词
第一章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 DNA聚合酶结构、功能及其复制的分子机制
        1.1.2 DNA损伤及甲基化修饰
        1.1.3 人类DNA聚合酶eta结果与生物学功能分析
        1.1.4 DNA聚损伤与人类疾病
    1.2 研究目的及意义
    1.3 研究内容及技术路线
第二章 材料与仪器
    2.1 分析软件
    2.2 实验仪器
    2.3 实验试剂耗材
    2.4 实验所需缓冲液
第三章 实验方法
    3.1 DNA聚合酶hPolη的制备
        3.1.1 HPolη的诱导表达
        3.1.2 菌体裂解
        3.1.3 HPolη过Hitrap^TM FF柱纯化
    3.2 DNA底物制备
        3.2.1 DNA引物合成
        3.2.2 P(32)标记单链DNA
        3.2.3 制备dsDNA底物模板
    3.3 制备20%、8M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶
    3.4 HPolη活性验证实验
    3.5 HPolη催化的全长延伸实验
    3.6 稳态动力学分析hPolη催化单个dNTP插入实验
    3.7 稳态动力学分析hPolη催化单个dNTP插入下一位的延伸实验
    3.8 稳态前动力学分析hPolη催化单个核苷酸插入的效率
        3.8.1 稳态前动力学分析变化反应时间进行单个核苷酸的插入
        3.8.2 HPolη酶活性滴定实验
        3.8.3 稳态前动力学分析改变dNTP浓度与时间进行单个核苷酸的插入
    3.9 表面等离子共振(SPR)检测hPolη与不同dsDNA的结合能力
        3.9.1 分析hPolη在没有dNTP与Mg²⁺参与条件下与DNA的结合能力
        3.9.2 分析hPolη在dTTP、dCTP和 Mg²⁺存在下与DNA的结合能力
第四章 实验结果
    4.1 DNA聚合酶hPolη的表达纯化
        4.1.1 HPolη的小量诱导表达
        4.1.2 HPolη的大量诱导表达及纯化
    4.2 HPolη的酶活性验证
    4.3 DNA模板上的6mA和 I抑制聚合酶eta进行全长延伸
    4.4 DNA模板上的6mA和 I降低单个核苷酸插入的效率
    4.5 DNA模板上的6mA和 I降低hPolη催化下一个核苷酸插入的效率
    4.6 HPolη催化单个核苷酸插入的稳态前动力学分析
        4.6.1 稳态前动力学分析变化反应时间进行单个核苷酸的插入
        4.6.2 模板上的6mA和 I削弱了DNA聚合酶与DNA模板的结合能力
        4.6.3 改变dNTP浓度与时间的稳态前动力学分析
    4.7 DNA模板上6mA和 I降低聚合酶eta与 DNA模板的亲和力
        4.7.1 HPolη在没有dNTP和 Mg²⁺参与条件下与dsDNA的亲和力
        4.7.2 HPolη在dNTP和 Mg²⁺参与条件下与dsDNA亲和力
第五章 结论与讨论
    5.1 结论
    5.2 讨论
        5.2.1 DNA损伤降低聚合酶催化的保真性
        5.2.2 DNA损伤影响DNA结构的稳定性
        5.2.3 DNA的甲基化修饰降低核苷酸插入效率及与蛋白酶的亲和力
全文总结与展望
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文



本文编号：3777502