三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究
发布时间：2023-04-09 15:26
近年来,长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)对于人类健康的重要性越来越受到重视。目前人类获取LC-PUFA的主要来源是深海鱼油,然而鱼油面临资源短缺和环境污染的风险,因此需要寻找新的替代来源。海洋微藻能从头合成LC-PUFA,是海洋LC-PUFA的初级生产者。海洋微藻LC-PUFA合成代谢途径的研究对于开发LC-PUFA的替代来源具有重要的意义。长链酰基辅酶A合成酶(LACS)在脂肪酸代谢中起关键作用。游离脂肪酸必须在LACS催化作用下活化成酰基辅酶A,才能进入后续脂肪酸的代谢途径,如碳链延长、甘油三酯合成、糖脂合成、磷脂合成、β氧化等。研究LACS在产油微藻脂肪酸代谢中的功能有助于全面解析LC-PUFA的合成途径。本论文以富含LC-PUFA的海洋微藻-三角褐指藻为对象,采用分子生物学和生化等方法研究五个长链酰基辅酶A合成酶(ptACSL1-5)的生化特性。主要研究结果如下:(1)采用逆转录PCR扩增ptACSL1-4编码基因,分别构建ptACSL1-4与GFP的融合表达质粒,转化三角褐指藻,通过观察GFP荧光确定其亚细胞定位。结果表明:ptACSL1、ptACSL2和ptACSL3定...
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 微生物来源的长链多不饱和脂肪酸
1.1.1 长链多不饱和脂肪酸的营养功效
1.1.2 微生物长链多不饱和脂肪酸的基本合成途径
1.2 产油硅藻油脂代谢研究进展
1.2.1 产油硅藻简介
1.2.2 产油硅藻脂肪酸从头合成途径
1.2.3 产油硅藻甘油三酯合成途径
1.2.4 产油硅藻甘油糖脂合成途径
1.2.5 产油硅藻脂肪酰基在不同脂类中的流向
1.3 长链酰基CoA合成酶
1.3.1 长链酰基CoA合成酶简介
1.3.2 大肠杆菌和酿酒酵母的酰基CoA合成酶的研究进展
1.3.3 植物长链酰基CoA合成酶的研究进展
1.3.4 产油微藻的长链酰基CoA合成酶的研究进展
1.4 硅藻基因组编辑研究进展
1.4.1 基因组编辑技术简介
1.4.2 CRISPR/Cas9 技术简介
1.4.3 硅藻基因组编辑研究进展
1.5 本研究的目的和内容
第二章 ptACSL蛋白亚细胞定位
2.1 引言
2.2 实验材料与仪器
2.2.1 菌株与培养条件
2.2.2 实验试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 培养基与溶液
2.2.5 引物与质粒
2.3 实验方法
2.3.1 三角褐指藻ptACSL1-4 基因的克隆
2.3.2 蛋白定位预测
2.3.3 蛋白跨膜预测
2.3.4 GFP融合表达载体的构建
2.3.5 ptACSL1的GFP自组装载体构建
2.3.6 三角褐指藻基因枪转化
2.3.7 三角褐指藻的GFP载体转化子的筛选和检测
2.3.8 三角褐指藻共聚焦荧光观察
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 ptACSL1-4的GFP融合载体以及ptACSL1GFP自组装载体的构建
2.4.2 ptACSL1-5 蛋白的亚细胞定位
2.5 小结
第三章 ptACSL的异源表达和底物特异性分析
3.1 引言
3.2 实验材料与仪器
3.2.1 菌株与培养条件
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验仪器
3.2.4 培养基与溶液
3.2.5 引物与质粒
3.3 实验方法
3.3.1 ptACSL大肠杆菌表达载体的构建
3.3.2 大肠杆菌异源表达ptACSL蛋白
3.3.3 ptACSL蛋白纯化
3.3.4 ptACSL蛋白酶活测定
3.4 实验结果和讨论
3.4.1 大肠杆菌异源表达ptACSL蛋白
3.4.2 ptACSL蛋白的酶活测定
3.5 小结
第四章 ptACSL蛋白表达模式分析
4.1 引言
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 菌株与培养条件
4.2.2 实验试剂
4.2.3 实验仪器
4.2.4 培养基与溶液
4.3 实验方法
4.3.1 三角褐指藻的缺氮培养
4.3.2 三角褐指藻的不同CO2浓度培养
4.3.3 ptACSL蛋白的Western blot检测
4.4 实验结果和讨论
4.4.1 缺氮条件下ptACSL蛋白的表达模式
4.4.2 不同CO2浓度培养下ptACSL蛋白的表达模式
4.5 小结
第五章 ptACSL基因敲除
5.1 引言
5.2 实验材料与仪器
5.2.1 菌株与培养条件
5.2.2 实验试剂
5.2.3 实验仪器
5.2.4 培养基与溶液
5.2.5 引物和质粒
5.3 实验方法
5.3.1 ptACSL基因的sgRNA设计
5.3.2 sgRNA表达盒的构建
5.3.4 基因敲除株的筛选
5.3.5 基因敲除株的验证
5.4 实验结果与讨论
5.4.1 ptACSL基因的sgRNA设计
5.4.2 ptACSL基因敲除突变株的筛选
5.4.3 ptACSL基因敲除突变株的验证
5.5 小结
第六章 讨论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3787265
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 微生物来源的长链多不饱和脂肪酸
1.1.1 长链多不饱和脂肪酸的营养功效
1.1.2 微生物长链多不饱和脂肪酸的基本合成途径
1.2 产油硅藻油脂代谢研究进展
1.2.1 产油硅藻简介
1.2.2 产油硅藻脂肪酸从头合成途径
1.2.3 产油硅藻甘油三酯合成途径
1.2.4 产油硅藻甘油糖脂合成途径
1.2.5 产油硅藻脂肪酰基在不同脂类中的流向
1.3 长链酰基CoA合成酶
1.3.1 长链酰基CoA合成酶简介
1.3.2 大肠杆菌和酿酒酵母的酰基CoA合成酶的研究进展
1.3.3 植物长链酰基CoA合成酶的研究进展
1.3.4 产油微藻的长链酰基CoA合成酶的研究进展
1.4 硅藻基因组编辑研究进展
1.4.1 基因组编辑技术简介
1.4.2 CRISPR/Cas9 技术简介
1.4.3 硅藻基因组编辑研究进展
1.5 本研究的目的和内容
第二章 ptACSL蛋白亚细胞定位
2.1 引言
2.2 实验材料与仪器
2.2.1 菌株与培养条件
2.2.2 实验试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 培养基与溶液
2.2.5 引物与质粒
2.3 实验方法
2.3.1 三角褐指藻ptACSL1-4 基因的克隆
2.3.2 蛋白定位预测
2.3.3 蛋白跨膜预测
2.3.4 GFP融合表达载体的构建
2.3.5 ptACSL1的GFP自组装载体构建
2.3.6 三角褐指藻基因枪转化
2.3.7 三角褐指藻的GFP载体转化子的筛选和检测
2.3.8 三角褐指藻共聚焦荧光观察
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 ptACSL1-4的GFP融合载体以及ptACSL1GFP自组装载体的构建
2.4.2 ptACSL1-5 蛋白的亚细胞定位
2.5 小结
第三章 ptACSL的异源表达和底物特异性分析
3.1 引言
3.2 实验材料与仪器
3.2.1 菌株与培养条件
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验仪器
3.2.4 培养基与溶液
3.2.5 引物与质粒
3.3 实验方法
3.3.1 ptACSL大肠杆菌表达载体的构建
3.3.2 大肠杆菌异源表达ptACSL蛋白
3.3.3 ptACSL蛋白纯化
3.3.4 ptACSL蛋白酶活测定
3.4 实验结果和讨论
3.4.1 大肠杆菌异源表达ptACSL蛋白
3.4.2 ptACSL蛋白的酶活测定
3.5 小结
第四章 ptACSL蛋白表达模式分析
4.1 引言
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 菌株与培养条件
4.2.2 实验试剂
4.2.3 实验仪器
4.2.4 培养基与溶液
4.3 实验方法
4.3.1 三角褐指藻的缺氮培养
4.3.2 三角褐指藻的不同CO2浓度培养
4.3.3 ptACSL蛋白的Western blot检测
4.4 实验结果和讨论
4.4.1 缺氮条件下ptACSL蛋白的表达模式
4.4.2 不同CO2浓度培养下ptACSL蛋白的表达模式
4.5 小结
第五章 ptACSL基因敲除
5.1 引言
5.2 实验材料与仪器
5.2.1 菌株与培养条件
5.2.2 实验试剂
5.2.3 实验仪器
5.2.4 培养基与溶液
5.2.5 引物和质粒
5.3 实验方法
5.3.1 ptACSL基因的sgRNA设计
5.3.2 sgRNA表达盒的构建
5.3.4 基因敲除株的筛选
5.3.5 基因敲除株的验证
5.4 实验结果与讨论
5.4.1 ptACSL基因的sgRNA设计
5.4.2 ptACSL基因敲除突变株的筛选
5.4.3 ptACSL基因敲除突变株的验证
5.5 小结
第六章 讨论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3787265
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3787265.html
教材专著
