家蚕外围食膜空间蛋白质组及几丁质脱乙酰基酶研究

发布时间：2023-04-29 18:42

　　昆虫围食膜是中肠上皮细胞分泌的由几丁质和蛋白质构成的薄膜,具有两个重要的生理功能。第一,围食膜是天然的物理屏障,其隔离食物与上皮细胞,可抵御外源有害物质的入侵。干扰或破坏围食膜结构,将促进病原微生物或杀虫剂对昆虫的侵害,影响昆虫正常发育,导致死亡。因此,围食膜是害虫防治中重要的作用对象,参与围食膜形成和维持其结构稳定的关键蛋白被认为是潜在的生物防治靶标。第二,围食膜为中肠不同区室的功能分化提供结构基础,其将中肠分隔为上皮细胞、外围食膜空间(EcPS)和内围食膜空间,其中EcPS是位于上皮细胞与围食膜之间的空腔,是唯一未被研究的中肠区室,包含大量上皮细胞分泌蛋白,这些蛋白可能参与围食膜的形成和结构的动态变化。因此,对于EcPS蛋白的研究在以围食膜为作用对象的靶标发现中具有重要意义。家蚕作为鳞翅目害虫治理的靶标基因研究模型,其中肠组织发达、基因组信息已知,因此被广泛应用于昆虫围食膜的研究。本论文以家蚕为研究材料,开展两部分研究工作:一是EcPS蛋白质组学研究,鉴定获得在维持围食膜结构/形态完整性方面发挥重要作用的蛋白;二是根据蛋白质组结果,选取了参与围食膜几丁质修饰的几丁质脱乙酰基酶(CD...

【文章页数】：130 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
主要符号与缩写表
1 文献综述
    1.1 昆虫中肠的结构与功能
        1.1.1 昆虫中肠的解剖结构
        1.1.2 昆虫中肠的生理功能
        1.1.3 昆虫中肠各区室的蛋白组成
    1.2 昆虫几丁质脱乙酰基酶(CDA)
        1.2.1 昆虫CDA的分类
        1.2.2 昆虫CDA的功能
        1.2.3 昆虫CDA的生化性质
        1.2.4 昆虫CDA的应用
    1.3 CDA的结构生物学研究进展
        1.3.1 真菌CDA的结构
        1.3.2 细菌CDA的结构
    1.4 选题依据和研究内容
        1.4.1 选题依据
        1.4.2 研究内容
2 家蚕中肠外围食膜空间(EcPS)蛋白质组研究
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 家蚕中肠EcPS的蛋白提取
        2.2.2 iTRAQ样品制备和TMT标记
        2.2.3 高效液相-串联质谱法(LC-MS/MS)分析
        2.2.4 数据库检索及蛋白鉴定
        2.2.5 生物信息学分析
        2.2.6 Real-time PCR
    2.3 实验结果
        2.3.1 EcPS蛋白质组数据分析
        2.3.2 五龄第五天和游走期EcPS分泌蛋白的比较
        2.3.3 EcPS蛋白的时间和空间表达特异性
    2.4 分析与讨论
        2.4.1 EcPS的生理功能
        2.4.2 游走期EcPS蛋白的分析
        2.4.3 中肠不同部位的生理功能
    2.5 本章小结
3 家蚕中肠CDA的序列分析、重组表达及生化性质表征
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 序列分析
        3.2.3 基因表达模式分析
        3.2.4 基因克隆、重组表达载体的构建及转化
        3.2.5 蛋白重组表达及分离纯化
        3.2.6 酶学活性测定
        3.2.7 几丁质结合能力测定
    3.3 实验结果
        3.3.1 序列分析
        3.3.2 BmCDA6、BmCDA7和BmCDA8基因表达模式分析
        3.3.3 基因克隆、重组表达和分离纯化
        3.3.4 BmCDA6、BmCDA7和BmCDA8的酶学活性
        3.3.5 BmCDA6、BmCDA7和BmCDA8的几丁质结合能力
    3.4 分析与讨论
        3.4.1 BmCDA6、BmCDA7和BmCDA8的酶学活性
        3.4.2 BmCDA6、BmCDA7和BmCDA8的生理功能
    3.5 本章小结
4 家蚕中肠CDA的晶体结构与功能关系
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 结晶条件的筛选和优化
        4.2.2 X射线衍射数据收集
        4.2.3 重原子及硒代晶体的筛选
        4.2.4 晶体结构解析
        4.2.5 结构分析与比较
        4.2.6 脱乙酰基作用模式分析
        4.2.7 分子动力学模拟和氨基酸定点突变验证
        4.2.8 BmCDA1活性测定和蛋白相互作用
    4.3 实验结果
        4.3.1 BmCDA8晶体生长、数据收集和结构解析
        4.3.2 BmCDA8的整体结构
        4.3.3 BmCDA8的活性位点
        4.3.4 BmCDA8底物结合裂缝的分析
        4.3.5 BmCDA8脱乙酰基作用模式
        4.3.6 分子动力学模拟
        4.3.7 结合位点突变验证
        4.3.8 BmCDA8与BmCDA6、BmCDA7的结构比较
        4.3.9 BmCDA1-CAD的催化机制和蛋白结构
    4.4 分析与讨论
        4.4.1 BmCDA8的独特结构
        4.4.2 BmCDA8脱乙酰基作用模式的结构基础
        4.4.3 结构与功能关系
    4.5 本章小结
5 结论与创新点
    5.1 结论
    5.2 创新点
    5.3 展望
参考文献
作者简介
攻读博士学位期间科研项目及科研成果
致谢



本文编号：3805532