恶臭假单胞菌KT2440中FinR对介导烟酸代谢的nicC和nicX操纵子的调控

发布时间：2023-05-14 01:10

　　恶臭假单胞菌KT2440是一种具有代谢多样性且可适应不同环境的非致病的模式菌株。除用于研究基础代谢以外,恶臭假单胞菌KT2440还被广泛应用于生产实践。因此,研究该菌株的生存模式以及基础代谢途径对实际生产应用意义重大。FinR是假单胞菌中LysR家族转录调节因子,负责在氧化胁迫条件下诱导铁氧还蛋白-NADP(+)还原酶Fpr-1的表达,增强菌株抵抗氧化胁迫的能力。除此信息外目前我们对FinR功能了解甚少。本研究通过转录组测序和qRT-PCR技术在恶臭假单胞菌KT2440中筛选出11个受finR调控的新靶基因,并进一步深入探究了FinR调控nicC和nicX操纵子的生理功能和机理。具体结果概括如下:1.转录组测序和qRT-PCR发现FinR显著调控nicC和nicX操纵子的表达前人研究发现FinR负责在氧化胁迫条件下诱导铁氧还蛋白-NADP(+)还原酶Fpr-1的表达,但其他功能知之甚少。为探究FinR的其他功能,本文首先通过转录组测序寻找相比野生型在finR突变体中表达有显著变化的基因,然后利用qRT-PCR实验验证转录组测序结果,发现可能受FinR调控的11个操纵子。其中,相比野生型...

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 恶臭假单胞菌KT2440
        1.1.1 恶臭假单胞菌KT2440简介
        1.1.2 恶臭假单胞菌KT2440的应用
    1.2 LysR家族转录调节因子-FinR
        1.2.1 LysR家族转录调节因子
        1.2.2 转录调节因子FinR的功能
    1.3 烟酸
        1.3.1 烟酸及其应用
        1.3.2 不同菌株中烟酸代谢通路
        1.3.3 假单胞菌中的烟酸代谢调控
    1.4 本文的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 试剂与仪器
            2.1.2.1 常用试剂
            2.1.2.2 主要仪器
            2.1.2.3 主要培养基及溶液配制
    2.2 方法
        2.2.1 菌株培养
        2.2.2 常见分子生物学基本操作
            2.2.2.1 大肠杆菌质粒DNA的分离(碱变性法)
            2.2.2.2 PCR纯化
            2.2.2.3 DNA酶切
            2.2.2.4 DNA凝胶回收
            2.2.2.5 DNA酶连
            2.2.2.6 大肠杆菌转化及感受态细胞的制备
        2.2.3 工具载体的构建
        2.2.4 通过两亲本接合方法将质粒导入KT2440中
        2.2.5 恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞的制备及电转化
        2.2.6 恶臭假单胞菌KT2440基因缺失突变体的构建
        2.2.7 β-半乳糖苷酶活性的测定
        2.2.8 表型实验菌落观察
        2.2.9 恶臭假单胞菌KT2440总RNA的抽提
        2.2.10 总RNA反转录
        2.2.11 qRT-PCR比较基因表达变化
        2.2.12 转录组测序
        2.2.13 BCA法检测蛋白浓度
        2.2.14 EMSA实验
        2.2.15 DNase I足迹测定实验
3 结果与分析
    3.1 转录组学分析揭示了受FinR影响的基因
        3.1.1 转录组测序
        3.1.2 恶臭假单胞菌KT2440中受FinR影响的基因
    3.2 FinR正调控nicC和nicX操纵子
        3.2.1 qRT-PCR和nic启动子-lacZ融合表达检测FinR对nic簇基因表达的作用
    3.3 FinR缺失削弱了菌株对烟酸的利用率
        3.3.1 液体培养基中菌株生长曲线测定
        3.3.2 固体培养基中的菌株烟酸利用实验
    3.4 FinR与NicR协同调控nicC和nicX操纵子
    3.5 FinR和NicR可在体外结合nicC和nicX启动子
        3.5.1 EMSA实验确定FinR/NicR是否结合nicC/nicX启动子
        3.5.2 DNase I足迹测定实验确定FinR/NicR与 nicC/nicX启动子结合位点
4 讨论与展望
    4.1 讨论
        4.1.1 FinR影响菌株烟酸代谢
        4.1.2 FinR调控组氨酸利用相关基因的表达
        4.1.3 氧化应激对nicC和nicX操纵子的表达没有明显影响
        4.1.4 FinR与nicC和nicX启动子的精确结合序列
    4.2 展望
参考文献
附录A 转录组测序结果
附录B 本文所用引物
附录C 论文发表和待发表情况
致谢



本文编号：3816886