二硫键Cys139-Cys206影响人胰蛋白酶的稳定性

发布时间：2023-08-29 23:54

　　胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可特异切割精氨酸及赖氨酸C端肽键。重组人源阳离子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的稳定性明显高于重组人源阴离子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比较ht1和ht2的氨基酸序列和三维结构,二者的氨基酸序列同源性为95%,rht1比rht2多1对二硫键Cys139-Cys206。为解释该二硫键对其稳定性的作用,构建rht1的Cys139-Cys206二硫键缺失突变体rht1-dC139S-C206S和rht2的增加该对二硫键的突变体rht2-S139C-S206C。进行了重组表达和纯化,并测定rht1、rht2及两个突变体的酶学性质,对比其稳定性。结果发现,与野生型rht1、rht2相比,突变体的酶学动力学参数km和kcat值与最适pH均未有较大差异。但在pH3～12条件下的稳定性,rht1-dC139S-C206S比rht1低46.6%;rht2-S139C-S206C比rht2高30.3%。对比其热稳定性,40℃保温4 h,rht1残余活性为92...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 重组质粒的构建及酶的重组表达和纯化
    1.3 活性测定
    1.4 纯度测定
    1.5 酶促反应动力学测定
        1.5.1 最适pH和最适温度的测定
            1.5.1.1最适pH的测定:
            1.5.1.2最适温度的测定:
    1.6 对酶稳定性影响
        1.6.1 二硫键突变对酶pH稳定性影响
        1.6.2 二硫键突变对酶热稳定性影响
    1.7 结构分析
2 结果
    2.1 重组质粒构建及酶的重组表达和纯化
    2.2 rht1二硫键缺失和rht2二硫键增加未改变催化效率
    2.3 rht1二硫键缺失和rht2二硫键增加对最适pH无影响
    2.4 二硫键增加升高rht2最适温度
    2.5 二硫键缺失降低ht1的pH稳定性, 二硫键增加提高ht2的pH稳定性
    2.6 二硫键缺失降低rht1的热稳定性,二硫键增加提高rht2的热稳定性
    2.7 高级结构模拟分析C139-C296二硫键对结构的作用
    2.8 二硫键缺失使rht1-dC139S-C206S降解增加,二硫键增加使rht2-S139C-S206C降解减少
3 讨论



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